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Apr 26, 2023

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Communications Biology volume 6, Article number: 164 (2023) Citer cet article

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Les organoïdes rétiniens tridimensionnels (rétines 3D) sont une source de greffe prometteuse pour la thérapie de transplantation. Nous avons précédemment développé une culture auto-organisatrice pour la génération de rétine 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Nous présentons ici une méthode de contrôle de la qualité et des études précliniques pour la transplantation de tissu-feuille. Les hPSC auto-organisés se différencient en tissus rétiniens et hors cible. Les analyses de l'expression génique ont identifié les principaux tissus hors cible comme étant des tissus liés aux yeux, de type cortex et de type moelle épinière. Pour le contrôle de la qualité, nous avons développé un test basé sur la qPCR dans lequel chaque neuroépithélium dérivé de hPSC a été disséqué en deux feuilles de tissu : une feuille centrale interne pour la transplantation et une feuille périphérique externe pour la qPCR afin d'assurer la sélection des tissus rétiniens. Au cours de la qPCR, les feuilles de tissus ont été stockées pendant 3 à 4 jours à l'aide d'une méthode de conservation nouvellement développée. Dans une étude de tumorigénicité chez le rat, aucun événement indésirable lié à la greffe n'a été observé. Chez les rats modèles de dégénérescence rétinienne, les transplants rétiniens se sont différenciés en photorécepteurs matures et ont présenté des réponses lumineuses dans les tests électrophysiologiques. Ces résultats démontrent notre justification envers la thérapie de greffe de feuille rétinienne auto-organisée.

Les cellules souches pluripotentes (CSP) ont la capacité d'auto-organiser le tissu neural tridimensionnel (3D)1. Les agrégats auto-organisés avec des tissus 3D sont appelés organoïdes et représentent des sources de greffe prometteuses pour la thérapie de transplantation de cellules/tissus. Vers la thérapie de transplantation rétinienne humaine, plusieurs méthodes de différenciation rétinienne ont été développées2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Parmi eux, une technologie de culture de cellules souches auto-organisatrice, SFEBq (culture flottante sans sérum d'agrégats ressemblant à des corps embryoïdes avec agrégation rapide), est utile pour la génération de rétine 3D5,6,7,8,15,17. Nous avons précédemment modifié la méthode SFEBq par traitement minuté de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) pour générer des rétines 3D à partir de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) sans alimentation et de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)7,8. Les rétines 3D de ce système de culture contiennent des progéniteurs rétiniens neuraux (rétiniens) qui se dilatent pour donner naissance à des photorécepteurs et à d'autres neurones rétiniens et forment un tissu rétinien stratifié multicouche d'une manière dépendante du stade, récapitulant le développement in vivo.

La rétinite pigmentaire est un groupe de maladies héréditaires caractérisées par une perte progressive des photorécepteurs en bâtonnets suivis des photorécepteurs en cônes, et est la principale cause de cécité dans les pays développés. La transplantation de photorécepteurs et/ou de progéniteurs rétiniens est une option thérapeutique prometteuse23,24,25,26. En effet, la transplantation de tissus rétiniens et de cellules à partir de tissus embryonnaires primaires avait le potentiel d'améliorer la fonction visuelle23,27,28,29, bien que les contributions de la greffe de tissu/cellule et du transfert de matériel donneur-hôte restent à étudier30. Pour fournir des quantités adéquates de tissus et de cellules rétiniennes pour la thérapie cellulaire, les rétines 3D générées à partir de CSP représentent une source de greffe prometteuse. Les précurseurs de photorécepteurs purifiés à partir de rétines dérivées de PSC peuvent survivre, entrer en contact avec la rétine de l'hôte et améliorer la fonction visuelle10,17,18,26,31,32. Des feuilles de tissu rétinien de souris et d'humain (feuilles rétiniennes ci-après) disséquées à partir de rétines 3D se sont greffées sur des souris et des rats modèles de dégénérescence rétinienne en phase terminale et ont présenté une maturation fonctionnelle qui a entraîné la restauration des réponses lumineuses33,34,35,36,37. De plus, les rétines 3D dérivées de hPSC avaient une faible immunogénicité et des propriétés immunosuppressives38. La transplantation de feuilles PSC-rétiniennes humaines dans des modèles primates de dégénérescence rétinienne a montré une prise de greffe à long terme pendant 2 ans36,39. Ces études précliniques de transplantation indiquent que les feuilles rétiniennes allogéniques dérivées de PSC ont le potentiel d'améliorer la fonction visuelle.

Vers des applications cliniques sur les feuillets rétiniens dérivés de PSC, la mise en place d'une stratégie de contrôle qualité (CQ) pour les rétines 3D (produits intermédiaires) et les feuillets rétiniens disséqués (produits finaux) est restée un défi majeur. La culture auto-organisée a été améliorée pour réduire la variation des organoïdes aux niveaux intra-lot et inter-lot. Eiraku et ses collègues ont développé la méthode SFEBq pour réguler la taille et la qualité des agrégats dérivés de PSC5,40. Nous avons développé un système de culture modifié pour réduire la variété de la qualité des organoïdes, telles que les morphologies organoïdes et les proportions de la rétine neurale (rétine) et de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE)7,8, bien que les organoïdes individuels présentent toujours diverses morphologies 3D et de multiples off- tissus cibles. Certains tissus hors cible ont été identifiés comme des tissus RPE et des tissus de type cortex7,12. Nos précédentes études de transplantation utilisaient des lignées PSC hébergeant des lignées de rapporteurs knock-in de protéines fluorescentes pour Rx (également appelées Rax) et Crx pour étiqueter les cellules rétiniennes adaptées à la transplantation6,35,39. Cependant, les lignées rapporteurs knock-in de protéines fluorescentes xénogéniques ne sont pas idéales pour les applications cliniques. Ici, nous établissons une nouvelle stratégie QC pour sélectionner le tissu rétinien dans les organoïdes. Nous avons ensuite réalisé des études précliniques d'innocuité et d'efficacité pour démontrer la justification de la thérapie allogénique de greffe de feuillet rétinien.

Vers la thérapie de greffe de tissu rétinien, nous avons développé une méthode de différenciation rétinienne robuste composée de cinq processus basés sur des études antérieures : 5, 6, 7, 8, 33, 39 (1) culture d'entretien avec culture hPSC sans alimentation et méthodes de préconditionnement, ( 2) différenciation rétinienne avec les méthodes SFEBq et BMP, (3) culture d'induction-inversion, (4) culture de maturation et (5) dissection (Fig. 1a).

un Schéma de la culture auto-organisatrice. b Vue en fond clair d'un agrégat de cellules dérivé d'iPSC-S17 contenant du tissu rétinien aux jours 14, 42, 91 et 180 (supérieur). Barre d'échelle en champ clair : 100 µm. Immunomarquage du tissu rétinien dérivé d'iPSC-S17 aux jours 14, 42, 91 et 180 (moyen et inférieur). Crx (vert) et Chx10 (rouge) dans les panneaux du milieu. Pax6 (vert) et Recoverin (rouge) dans les panneaux inférieurs. Bleu : coloration nucléaire au DAPI. Barre d'échelle en immunomarquage : 20 µm. c Immunomarquage du tissu rétinien dérivé d'iPSC-S17 au jour 180. RXRG (vert) et NRL (rouge) dans le panneau supérieur gauche. Lhx2 (rouge) dans le panneau supérieur droit. CtBP2 (vert) et Recoverin (rouge) dans le panneau inférieur gauche. Cone-arrestin (vert) dans le panneau inférieur droit. Bleu : coloration nucléaire au DAPI. Barre d'échelle : 20 µm. d Analyse de l'expression génique dans des agrégats cellulaires dérivés d'iPSC-S17 contenant du tissu rétinien aux jours 0, 6, 14, 45, 60 et 80. Dans chaque réplicat, l'ARN a été extrait de 48 agrégats. Les niveaux d'ARNm ont été déterminés par analyse qPCR. L'expression relative de l'ARNm a été déterminée par la méthode delta-delta Ct avec GAPDH comme contrôle endogène. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE (n = 4 par point dans le temps). e Vue en champ clair de la feuille rétinienne dérivée d'iPSC-S17. Barre d'échelle : 100 µm. f Immunomarquage de la feuille rétinienne dérivée d'iPSC-S17 au jour 87. Crx (vert) et Chx10 (rouge) dans le panneau de gauche. Rx (vert) et Recoverin (rouge) dans le panneau de droite. Bleu : coloration nucléaire au DAPI. Barre d'échelle : 100 µm.

Dans le processus 1, les lignées cellulaires iPSC humaines ont été maintenues sur la matrice LM511-E8 dans le milieu StemFit41,42. Quatre lignées cellulaires iPSC, iPSC-S17, iPSC-LPF11, iPSC-1231A3 et iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q), ont été développées de manière stable dans cette culture de maintenance sans alimentation, et leur temps de doublement était d'environ 12 à 18 h. Les iPSC ont été préconditionnés avec du SB431542 (SB ; inhibiteur de la signalisation TGF-bêta/Nodal/Activine) plus un agoniste lissé (SAG ; agoniste de la signalisation Shh) pendant 18 à 30 h avant la différenciation (SB + SAG ci-après)8. Dans le processus 2, la culture de différenciation rétinienne 3D a été réalisée à l'aide de la méthode SFEBq-BMP. Les iPSC ont été dissociés en cellules individuelles, plaqués dans des plaques à 96 puits à fond en V et cultivés dans un milieu de différenciation (CDM sans facteur de croissance [gfCDM] + Remplacement de sérum knock-out [KSR]) en présence de Y-27632 et SAG8. Les agrégats iPSC résultants ont été traités avec BMP4 au jour 3 et cultivés dans du milieu gfCDM + KSR7. Au jour 14, les agrégats iPSC ont été fixés et immunocolorés pour les marqueurs progéniteurs rétiniens Pax6 et Chx10 (également appelés Vsx2). Il a été constaté que les agrégats iPSC contenaient un neuroépithélium à leur surface et que la majorité des cellules du neuroépithélium étaient positives pour Chx10 et Pax6, ce qui indique que les iPSC autoformaient du tissu rétinien immature (Fig. 1b). Dans le processus 3, le tissu rétinien immature a été cultivé à l'aide d'une méthode de culture d'induction-inversion pour réguler avec précision les proportions de rétine neurale (rétine) et RPE7. Le tissu rétinien immature a été cultivé avec CHIR99021 (CHIR ; agoniste Wnt) et SU5402 (SU ; inhibiteur de FGFR) pendant 3 jours pour biaiser les cellules vers le destin de RPE, puis cultivé dans un milieu de maturation de la rétine contenant du sérum et de la taurine pendant 23 jours pour obtenir un intermédiaire d'inversion d'induction. Dans le processus 4, l'intermédiaire d'induction-inversion a été ensuite cultivé dans un milieu de maturation de la rétine contenant du sérum, de la taurine et de la T3 pendant 20 à 60 jours pour obtenir la rétine 3D. Aux jours 60 à 100, la rétine 3D a été fixée et immunocolorée pour Chx10, Pax6, Crx (marqueur précurseur du photorécepteur) et Recoverin (marqueur du photorécepteur). La rétine 3D s'est avérée contenir un tissu rétinien multicouche, comprenant une couche précurseur de photorécepteur avec des cellules Crx + et Recoverin + sur la surface externe, une couche progénitrice rétinienne avec des cellules Chx10 + / Pax6 + au milieu et une couche neuronale avec Chx10 - / Pax6 ++ cellules et cellules Crx + et Recoverin + sur la face interne (Fig. 1b et Fig. 1a, b, c supplémentaires).

Nous avons en outre cultivé des rétines 3D dans un milieu de maturation à long terme contenant de l'acide rétinoïque tout-trans pour examiner l'expression des marqueurs de maturation rétinienne. Il a été confirmé que les rétines 3D au jour 180 contenaient un tissu rétinien multicouche avec des couches de photorécepteurs et de progéniteurs rétiniens (Fig. 1b, c). Des cellules NRL +, RXRG + et Cone-arrestin + ont été trouvées dans la couche photoréceptrice externe de la rétine 3D, indiquant une différenciation en précurseurs de bâtonnets et en précurseurs de cônes (Fig. 1c). La couche neuronale Lhx2 + a été trouvée sur la face interne de la rétine 3D (Fig. 1c). Certaines cellules Recoverin + exprimaient CtBP2 (également appelé Ribeye), ce qui suggère que les photorécepteurs dérivés d'iPSC avaient la capacité d'exprimer des protéines synaptiques photoréceptrices (Fig. 1c et Supplémentaire Fig. 1d).

Pour analyser l'expression des gènes, nous avons effectué des analyses qPCR d'agrégats iPSC aux jours 0, 6, 14, 45, 60 et 80 (Fig. 1d et Supplémentaire Fig. 1e). Les niveaux d'ARNm des marqueurs progéniteurs rétiniens (Rx, Chx10), des marqueurs photorécepteurs (Crx, Recoverin) et d'un marqueur précurseur du photorécepteur conique (RXRG) ont augmenté au jour 6-14, au jour 45 et au jour 60, respectivement. Le niveau d'ARNm du marqueur PSC Oct3/4 a diminué au jour 6. Ces données sont cohérentes avec les précédentes études de culture de différenciation rétinienne 3D5,6,7,8.

Dans le processus 5, les rétines 3D aux jours 60 à 100 ont été disséquées en feuilles rétiniennes (produits finaux) (Fig. 1e)33,39. Nous avons vérifié la morphologie des feuillets rétiniens par analyse immunohistochimique (IHC) et observé un tissu rétinien continu multicouche avec une couche précurseur de photorécepteurs contenant des cellules Crx+ et Recoverin+ sur la surface externe et une couche de cellules progénitrices rétiniennes avec des cellules Chx10+ et Rx+ sur la face interne. (Fig. 1f). À l'aide de ces cinq processus, des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC allogéniques humaines ont été générées de manière reproductible.

La culture auto-organisée a imité le développement embryonnaire pour induire à la fois le tissu rétinien et les tissus hors cible. Nous avons cherché à identifier les principaux tissus hors cible dans cette culture en fonction de la morphologie des agrégats. Les cellules iPSC-LPF11 différenciées vers le destin rétinien par culture auto-organisée ont été soumises à une analyse par microscopie en champ clair. Nous avons constaté que les cellules iPSC-LPF11 s'auto-organisaient en tissu rétinien et en trois tissus hors cible qui avaient des morphologies différentes du tissu rétinien (tissu hors cible-1, -2 et -3) (Fig. 2a). La morphologie typique du tissu rétinien était la structure continue multicouche du neuroépithélium avec une couche externe brillante et une couche interne brune (Figs. 1b et 2a). Les morphologies typiques des tissus hors cible étaient un épithélium ridé pigmenté et/ou non pigmenté (tissu hors cible-1), des agrégats de cellules collantes avec une surface externe rugueuse (tissu hors cible-2) et des tissus sombres. agrégats colorés avec une partie interne obstruée (tissu hors cible-3) (Fig. 2a). Nous avons différencié trois lots de culture indépendants de deux lignées cellulaires, iPSC-LPF11 et iPSC-S17, et examiné les proportions d'agrégats contenant du tissu rétinien et des tissus hors cible (Fig. 2b, n = 59–95 agrégats par lot). Pour tous les lots, la plupart des agrégats contenaient du tissu rétinien et la proportion d'agrégats contenant du tissu hors cible-1 avait tendance à être plus élevée que la proportion d'agrégats contenant du tissu hors cible-2 ou du tissu hors cible-3.

une vue en champ clair du tissu rétinien et des tissus hors cible dans des agrégats de cellules dérivés d'iPSC-LPF11. Barre d'échelle : 100 µm. b Proportions d'agrégats cellulaires contenant du tissu rétinien et des tissus hors cible. Trois lots indépendants dérivés de cellules iPSC-LPF11 et trois lots indépendants dérivés de cellules iPSC-S17 ont été analysés (n = 59–95 agrégats par lot). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE. c Carte thermique pour les expressions géniques dans le tissu rétinien et les tissus hors cible dérivés de cellules iPSC-LPF11. En tant que contrôle, les expressions géniques dans les cellules iPSC-LPF11 indifférenciées sont également présentées. Les expressions géniques ont été mesurées par des analyses qPCR. Les scores Z des lignes ont été calculés pour chaque tissu et tracés sous forme de carte thermique. d Images représentatives en champ clair et images IHC pour les tissus 1 et 2 hors cible dérivés de cellules iPSC-LPF11. Les images en fond clair et les images IHC ont été capturées aux mêmes positions. L'immunomarquage pour Aqp1 (en haut à droite ; rouge) et Emx2 (en bas à droite ; rouge) est affiché. Bleu : coloration nucléaire au DAPI. Barre d'échelle : 100 µm. e Carte thermique pour les expressions géniques dans le tissu rétinien et le tissu hors cible-3 dérivé de cellules iPSC-1231A3. Les niveaux d'ARNm ont été déterminés par analyse de puces à ADN. Les valeurs LogFC ont été calculées pour chaque gène et tracées sous forme de carte thermique. FC, changement de pli. Notez que le tissu hors cible-3 exprime des gènes Hox par rapport au tissu rétinien.

Pour identifier les lignées cellulaires, les tissus 1 hors cible dérivés d'iPSC, les tissus 2 hors cible et les tissus 3 hors cible ont été disséqués manuellement, éventuellement avec de petites quantités de tissus environnants, et les niveaux d'ARNm des gènes clés associés avec le choix du destin, la différenciation et/ou la structuration ont été déterminés par analyse qPCR. Sur la base des valeurs Ct pour chaque gène, nous avons calculé les scores Z pour chaque tissu et les avons tracés sous forme de carte thermique pour analyser les modèles d'expression génique dans les tissus (Fig. 2c). Nous avons constaté que le tissu 1 hors cible exprimait Aqp1 et Mitf, indiquant qu'il s'agissait d'un tissu lié aux yeux avec RPE et corps ciliaire43,44. Le tissu 2 hors cible exprimait Emx2, indiquant qu'il s'agissait d'un tissu de type cortex embryonnaire45. Le tissu hors cible-3 a montré une expression élevée du gène homéobox HoxB246,47. Le marqueur hPSC indifférencié Lin28a n'a pas été détecté dans les trois tissus hors cible ou dans le tissu rétinien48.

Nous avons effectué des analyses IHC et confirmé que le tissu-1 hors cible était positif pour l'EPR et le marqueur de corps ciliaire Aqp1, tandis que le tissu-2 hors cible était positif pour le marqueur cortical embryonnaire (télencéphalique dorsal) Emx2 (Fig. 2d et Supplémentaire Fig. 2a ). Nous avons étudié l'expression génique dans le tissu 3 hors cible par analyse de puces à ADN et avons constaté qu'il exprimait plusieurs gènes Hox, y compris HoxB2, indiquant qu'il s'agissait d'un tissu semblable à la moelle épinière neurale postérieure (Fig. 2e). Nous avons en outre confirmé que les modèles d'expression génique dans les tissus hors cible différaient de ceux des tissus rétiniens (Fig. 2b supplémentaire).

Collectivement, en utilisant une méthode de culture auto-organisée, les hPSC se sont différenciés de manière robuste pour former un tissu rétinien multicouche et les principaux tissus hors cible étaient les tissus liés aux yeux Aqp1 + (tissu hors cible-1), les tissus de type cortex Emx2 + (tissu hors cible -2) et HoxB2 + tissu semblable à la moelle épinière (tissu hors cible-3).

Le tissu rétinien auto-organisé avait une structure unique de neuroépithélium continu multicouche (Figs. 1 et 2). Par conséquent, nous pouvons identifier le tissu rétinien en observant attentivement les agrégats sous un microscope à fond clair pendant la dissection (processus 5). Cependant, les CSP de cette culture se sont différenciées non seulement en tissu rétinien, mais également en tissus hors cible (Fig. 2), ce qui présente un risque potentiel que les tissus hors cible soient disséqués pour générer le produit final. En vue d'applications cliniques, nous avons cherché à développer une méthode de CQ à sécurité intégrée pour assurer la sélection de feuillets rétiniens transplantables et éviter d'inclure par erreur des tissus non ciblés. Bien que le test QC basé sur qPCR pour toutes les feuilles rétiniennes soit un moyen sensible de détecter les tissus hors cible, l'exécution de ce test conduit à la destruction de toutes les feuilles rétiniennes transplantables. Pour éviter cette destruction, nous avons décidé de disséquer le neuroépithélium continu en deux feuillets tissulaires : le feuillet central interne pour la transplantation (nommé "bouchon") et le feuillet périphérique externe pour le test QC (nommé "anneau") (Fig. 3a ). Pour estimer l'expression génique de chaque feuillet central interne (bouchon), nous effectuons une analyse qPCR de chaque feuillet périphérique externe correspondant (anneau) (Fig. 3a; test PCR en anneau ci-après).

a Schéma pour la dissection du capuchon et de l'anneau et le test ring-PCR dans le processus 5 (dissection). b Images en fond clair (à gauche) et IHC (au milieu, à droite) d'un capuchon et d'un anneau représentatifs. Le capuchon et l'anneau ont été dérivés de cellules iPSC-LPF11. L'immunomarquage pour Crx (milieu, vert), Chx10 (milieu, rouge), Pax6 (droite, vert) et Recoverin (droite, rouge) est affiché. DAPI est affiché en bleu. Barre d'échelle : 100 µm. c Carte thermique pour les expressions géniques dans les coiffes et les anneaux dérivés de cellules iPSC-LPF11. En tant que contrôle, les expressions géniques dans les cellules iPSC-LPF11 indifférenciées sont également présentées. Les expressions géniques ont été mesurées par des analyses qPCR. Les scores Z des lignes ont été calculés pour chaque capuchon et anneau, et tracés sous forme de carte thermique. d Expressions géniques représentatives dans le capuchon et l'anneau disséqués à partir du même agrégat représenté sous la forme d'un tracé avec une ligne de régression (à gauche). Le coefficient de détermination (R2) pour l'expression génique entre chaque capuchon et anneau est indiqué (à droite). #1–#6 correspondent aux tissus #1–#6 en (c). e Tracés de violon de données de PCR à cellule unique obtenues à partir d'une feuille rétinienne, d'un tissu hors cible-1, d'un tissu hors cible-2 et d'iPSC indifférenciés. Les expressions de gènes pour les cellules photoréceptrices (Crx, Recoverin), les cellules progénitrices rétiniennes (Chx10, Rx, Pax6), d'autres neurones rétiniens (Pax6, AP2A, STMN2) et les tissus hors cible (Aqp1, Emx2, HoxB2, Lin28a) sont montrées .

Le neuroépithélium continu, auto-formé dans la rétine 3D dérivée d'iPSC, a été disséqué dans le capuchon et l'anneau (Fig. 3a, b). Le capuchon et l'anneau contenaient tous deux un tissu rétinien continu multicouche comprenant une couche précurseur de photorécepteur avec des cellules Crx + et Recoverin + sur la surface externe et une couche de cellules progénitrices rétiniennes avec des cellules Chx10 + et Pax6 + sur la face interne.

Nous avons comparé les modèles d'expression génique dans les coiffes et les anneaux. Divers neuroépithéliums ont été disséqués dans les tissus de la coiffe et de l'anneau, et l'expression des gènes a été déterminée par qPCR (Fig. 3c). Nous avons constaté que les modèles d'expression génique dans chaque capuchon et anneau du même neuroépithélium étaient similaires. Pour analyser statistiquement la similarité, nous avons tracé des lignes de régression pour l'expression génique dans chaque capuchon et anneau et calculé le coefficient de détermination (R2). Nous avons constaté que les valeurs R2 pour tous les ensembles de capuchon et d'anneau étaient presque de 1,0 (Fig. 3d et Supplémentaire Fig. 3a, b). Ces données indiquent que les niveaux d'expression génique des gènes rétiniens et des gènes marqueurs tissulaires hors cible sont presque les mêmes entre la coiffe et l'anneau disséqués du même agrégat.

Ensuite, nous réalisons la qPCR de chaque anneau (Fig. 3a, test ring-PCR). Si un anneau exprime des gènes rétiniens et n'exprime pas autant de gènes marqueurs tissulaires hors cible tels que les tissus n ° 1 à 6 sur la figure 3c, le capuchon correspondant peut être sélectionné comme feuille rétinienne (produit final) pour la transplantation. Les feuillets rétiniens, dérivés de quatre lignées iPSC et ayant réussi le test PCR en anneau, ont en effet montré des modèles d'expression de gènes rétiniens similaires (Fig. 3c supplémentaire). Nous avons ensuite effectué une analyse par PCR unicellulaire (scPCR) et constaté que la majorité des cellules des feuilles rétiniennes exprimaient Chx10, Crx, Recoverin, Rx, Pax6, AP2A ou STMN2 (Fig. 3e).

Ces résultats ont démontré que le test PCR en anneau peut estimer l'expression génique dans la coiffe pour sélectionner des feuillets rétiniens composés de cellules rétiniennes.

Entre le processus de dissection et la greffe de feuillet rétinien, il est nécessaire d'effectuer des tests de CQ, y compris le test ring-PCR, pour sélectionner les feuillets rétiniens transplantables. Cependant, il faut au moins 1 à 2 jours pour terminer le test PCR en anneau. Bien que le tissu rétinien puisse être congelé et décongelé comme indiqué précédemment6,20, la transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien congelé chez des rats nude a montré une prise de greffe altérée. Nous avons donc cherché à développer une méthode de conservation sans congélation pour le tissu rétinien.

Nous avons d'abord examiné le milieu et la température optimaux pour la conservation sans congélation des rétines 3D dérivées d'iPSC et des feuilles rétiniennes disséquées. Pour déterminer le milieu optimal, nous avons évalué le milieu de maturation rétinienne, la solution de l'Université du Wisconsin (UW), la solution saline équilibrée (BSS) et Optisol-GS (Optisol ci-après), comme solutions de conservation candidates49,50,51, à 4, 17, et 37 °C. Des rétines 3D dérivées d'iPSC ont été générées, conservées pendant 3 jours dans diverses conditions et cultivées dans un milieu de maturation rétinienne à 37 ° C pendant 7 jours en tant que culture de récupération (Fig. 4a, b). Les rétines conservées et les rétines témoins ont été fixées et immunocolorées pour vérifier la morphologie du tissu rétinien. Nous avons constaté que la conservation à 17 ° C avec BSS ou Optisol était des conditions optimales pour maintenir la structure continue multicouche de l'épithélium rétinien (Fig. 4a). La conservation à 4 °C n'était pas une condition préférée, causant éventuellement des dommages à la rétine. La solution UW, un standard d'or pour la préservation des tissus périphériques, y compris le pancréas, n'a pas non plus été préférée. L'une des différences entre la solution UW et Optisol était la concentration de chlorure de potassium (KCl) : 120 mM dans la solution UW et 5,33 mM dans Optisol. En effet, Optisol additionné de KCl à 120 mM a altéré la morphologie du tissu rétinien (Fig. 4a supplémentaire). De manière constante, la concentration de KCl dans le BSS et le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM, milieu de base utilisé pour la culture de cellules de mammifères) était de 5, 3 mM et la conservation à 17 ° C dans le BSS et le DMEM s'est avérée préférable (Fig. 4a et Fig. 4b). Ces résultats soulèvent la possibilité que la concentration de KCl pourrait être un facteur clé pour la solution de conservation. Sur la base de ces résultats, nous avons choisi Optisol comme solution de conservation sans congélation, car Optisol est largement utilisé cliniquement pour la greffe de cornée humaine51.

a Dépistage des conditions de conservation hors gel. +++ : l'épithélium rétinien continu multicouche a été préservé. ++ : l'épithélium rétinien continu multicouche a été préservé mais des rosettes neurales sont apparues. + : un épithélium rétinien continu multicouche a été observé mais très limité. –, aucun épithélium rétinien continu multicouche n'a été observé après la conservation. b Schéma des expériences de conservation. c Proportions de précurseurs de photorécepteurs Crx+ dans les tissus rétiniens multicouches. Les proportions ont été calculées en divisant le nombre de cellules Crx+ par le nombre de noyaux (DAPI). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE pour n = 5 (4 °C), 4 (12 °C), 4 (15 °C), 5 (17 °C), 5 (20 °C), 5 (22 °C ), 4 (37 °C) et 3 (culture témoin). d Viabilité cellulaire dans les rétines non conservées (Contrôle) et les rétines conservées pendant 4 jours. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE (n = 5 par groupe). e Expressions géniques de Chx10 et Crx dans des rétines non conservées (contrôle) et des rétines conservées pendant 4 jours. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE (n = 3 par groupe). f Analyse IHC des rétines non conservées (j70+0), conservées en Optisol pendant 2 jours (j70+2) et 4 jours (j70+4), et conservées en Optisol pendant 4 jours suivi d'une culture de récupération pendant 3 jours ( j70 + 4 + 3) et 7 jours (j70 + 4 + 7). Coloration Ki67 (rouge) dans les panneaux supérieurs. Coloration EdU (vert) dans les panneaux inférieurs. DAPI est affiché en bleu. Barre d'échelle : 50 µm. g Nombre de cellules EdU-positives par tissu rétinien multicouche de 100 µm de large dans chaque groupe. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE (n = 6 par groupe). ***p < 0,001 pour une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test de Tukey. h Schéma de dissection, test PCR en anneau et expédition de feuillets rétiniens. ns, non significatif.

Pour déterminer la température optimale de conservation, les rétines 3D ont été conservées dans Optisol à 4, 12, 15, 17, 20, 22 et 37 °C pendant 3 jours, puis cultivées dans un milieu de maturation rétinienne à 37 °C pendant 7 jours comme la culture de récupération (Fig. 4b). Nous avons effectué une analyse IHC et constaté que les proportions de cellules Crx+ étaient plus élevées à 12, 15, 17, 20 et 22 °C qu'à 4 et 37 °C et que les proportions de cellules Crx+ à 17, 20 et 22 °C étaient beaucoup plus élevés (Fig. 4c). Ainsi, la plage préférable de température de conservation était de 17 ± 5 °C et la température optimale était de 17 à 22 °C.

Nous avons examiné la viabilité cellulaire et l'expression génique dans des rétines conservées dans Optisol à 17 ° C pendant 4 jours. La viabilité cellulaire dans les rétines préservées dépassait 95% et était similaire à celle des rétines témoins en culture (Fig. 4d). Les niveaux d'ARNm de Chx10 et Crx dans les rétines préservées étaient comparables à ceux des rétines témoins en culture (Fig. 4e). De plus, les niveaux d'ARNm de Chx10 et Crx dans les rétines conservées dans Optisol à 17 ° C pendant 7 jours étaient comparables à ceux des rétines témoins en culture. Ces résultats ont démontré que la conservation sans congélation dans Optisol à 17 °C était la condition optimale pour le tissu rétinien.

Nous avons analysé l'état des tissus rétiniens conservés à 17 °C. Rétines témoins avant conservation (j70 + 0), rétines conservées en Optisol à 17 °C pendant 2 jours (j70 + 2) et 4 jours (j70 + 4), et rétines récupérées par culture à 37 °C pendant 3 jours (j70 + 4 + 3) et 7 jours (j70 + 4 + 7) ont été traités avec l'analogue de la thymidine 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) pendant 4 h pour marquer les cellules proliférantes en phase S du cycle cellulaire et soumis à une analyse histologique analyse. L'expression de Ki67 a été détectée dans les rétines témoins avant conservation et dans les rétines conservées à 17 ° C (Fig. 4f, d70 + 2 et d70 + 4). En revanche, les cellules EdU + n'ont pas été détectées dans les rétines conservées à 17 ° C (Fig. 4f, g, j70 + 2 et j70 + 4), ce qui indique que les progéniteurs rétiniens conservés ont été arrêtés avant d'entrer en phase S. Il est important de noter que l'absorption d'EdU a été régulée à la hausse pendant la culture de récupération, ce qui indique que la capacité de prolifération était réversible (Fig. 4f, g et Supplémentaire Fig. 4c, d). Le nombre de cellules caspase-3+ clivées (cellules apoptotiques) était légèrement élevé dans les rétines préservées, tandis que les nombres dans les rétines récupérées (d70 + 4 + 3 et d70 + 4 + 7) étaient similaires à ceux des rétines témoins (supplémentaire figure 4c).

En combinant la méthode de conservation sans congélation à température ambiante contrôlée (méthode de conservation RT ci-après) avec le test PCR en anneau, nous avons développé une méthode QC pour la dissection des rétines 3D (processus 5) comme suit : (1) dissection de la bouchon et anneau de chaque rétine 3D, (2) conservation des bouchons à 17 °C par la méthode de conservation RT, (3) test PCR en anneau pour sélectionner les anneaux réussis et échoués, (4) exclusion des bouchons correspondant à anneaux défaillants pour sélectionner les feuilles rétiniennes (produits finaux) et (5) expédition des feuilles rétiniennes pour transplantation (Fig. 4h).

Une étude de tumorigénicité in vivo du feuillet rétinien a été réalisée par transplantation sous-rétinienne chez des rats nude immunodéficients. Des feuilles rétiniennes ont été générées à partir de cellules iPSC-Q et stockées par la méthode de conservation RT pendant 3 à 4 jours. Les rats nus immunodéficients ont été divisés en groupes intacts (n = 8), chirurgie factice (n = 12) et transplantés (n = 21), et les rats de ce dernier groupe ont subi une transplantation sous-rétinienne d'une feuille rétinienne dans l'espace sous-rétinien ( Fig. 5a–f supplémentaires). Chaque feuille rétinienne transplantée (greffe) était correctement localisée dans l'espace sous-rétinien, comme l'ont confirmé l'imagerie du fond d'œil et l'analyse par tomographie par cohérence optique (OCT) (Fig. 5b supplémentaire).

Les rats transplantés n'ont montré aucune anomalie dans leur poids corporel, leur taux de survie et leurs signes cliniques par rapport aux rats intacts ou simulés pendant la période d'observation allant jusqu'à 78 semaines après la transplantation (Fig. 5a, b).

Évolution temporelle du poids corporel ( a ) et courbes de survie de Kaplan – Meier ( b ) chez des rats nus dans l'étude de tumorigénicité. Intact : rat nu témoin sans chirurgie (n = 4). Sham : rat nude témoin avec injection sous-rétinienne de véhicule témoin (n = 4). Transplanté : rat nu avec transplantation sous-rétinienne d'une seule feuille rétinienne dérivée d'iPSC-Q (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE. c, d Coloration HE des coupes oculaires transplantées à 13, 26, 52 et 78 semaines après la transplantation. Barre d'échelle : 100 µm. e – h Immunomarquage de coupes oculaires transplantées pour les marqueurs nucléaires humains, les marqueurs rétiniens et Ki67. Barre d'échelle : 20 µm. e Immunomarquage pour HuNu (vert), Recoverin (rouge), Chx10 (blanc) et DAPI (bleu). f Immunomarquage pour Ku80 humain (vert), Ki67 (rouge) et DAPI (bleu). g Image à fort grossissement de l'immunomarquage du greffon (52 semaines) avec des anticorps pour Ku80 humain (vert), Ki67 (rouge) et DAPI (bleu). La flèche indique les cellules Ki67+ et Ku80+. h Pourcentages de cellules Ki67+ et Ku80+ parmi les cellules humaines Ku80+. Les données sont présentées sous forme de moyenne. Couche nucléaire interne INL.

L'analyse histopathologique des greffons à 13, 26, 52 et 78 semaines après la transplantation n'a révélé aucune caractéristique proliférative ou maligne telle qu'une atypie nucléaire (Fig. 5c, d). Des analyses IHC des greffons ont ensuite été réalisées (Fig. 5e–h). Les pourcentages de cellules humaines proliférantes (Ki67+ et Ku80+) parmi les cellules humaines (Ku80+) étaient <1 % à chaque instant, indiquant une prolifération très limitée des cellules greffées (Fig. 5f, g, h)52,53. Les cellules greffées se sont différenciées en photorécepteurs (Recoverin + et HuNu +) et en cellules bipolaires (Chx10 + et HuNu +) (Fig. 5e). Plus précisément, les feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-Q ont été greffées à> 1,5 ans après la transplantation, même dans des conditions de xénotransplantation.

Dans cette étude, aucune tumorigénicité et aucun autre effet indésirable lié aux feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-Q n'ont été observés.

Pour examiner si les feuillets rétiniens conservés pouvaient être greffés et se différencier en photorécepteurs matures dans un état gravement dégénéré, nous avons réalisé une étude de transplantation en utilisant des rats nus modèles de dégénérescence rétinienne en phase terminale portant un transgène de rhodopsine humaine muté (SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav nude rats , rats RD-nus ci-après)54,55. Des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC stockées par la méthode de conservation par RT pendant 3 à 4 jours ont été transplantées par voie sous-rétinienne chez des rats RD-nus âgés de 20 à 30 semaines. 24 à 44 semaines après la transplantation, les cellules bipolaires PKCalpha + et Recoverin + hôte / rat existaient toujours alors que les photorécepteurs hôte / rat étaient presque complètement dégénérés à ce stade (Fig. 6a et Supplémentaire Fig. 6a, zone de contrôle). Les photorécepteurs humains Recoverin + et Ku80 + se sont greffés dans les rétines de rat gravement dégénérées pour former des structures de rosettes de photorécepteurs (Fig. 6a 'et Supplémentaires Fig. 6b, c, d), conformément aux études précédentes8,35,36,39.

a–j' Immunomarquage d'yeux de rat transplantés avec des feuillets rétiniens dérivés d'iPSC-S17. Les feuillets rétiniens ont été transplantés dans l'espace sous-rétinien de rats RD-nus. Les rétines de rat ont été fixées à 263 jours après la transplantation (341 jours après le début de la différenciation). a, a' Immunomarquage pour Ku80 humain (vert), Recoverin (rouge) et PKCalpha (blanc). Zone témoin non transplantée (a). Zone greffée (a'). Pointes de flèches en (a) : cellules bipolaires de rat humain Ku80-, Recoverin+ et PKCalpha+. b–b" Immunomarquage pour Ku80 humain (vert), S-arrestin (rouge) et Cone-arrestin (blanc). La zone encadrée en (b) correspond à (b'). Grossissement élevé en (b') et grossissement supérieur en (b"). c–h' Immunomarquage pour les marqueurs photorécepteurs. NRL (vert), Recoverin (rouge) et RXRG (blanc) en (c, c'). S-opsine (vert) et L/M-opsine (rouge) en (d). GNAT1 (vert) et PRPH2 (rouge) en (e, e'). GNAT2 (vert) et PNA (rouge) en (f). Ku80 humain (vert), synaptophysine (rouge) et PKCalpha (blanc) dans (g – g "). Pointes de flèches dans (g ', g") : neurites positifs pour la synaptophysine dans aucun espace nucléaire. Human Ku80 (vert), Calbindin (rouge) et S-arrestin (blanc) en (h, h'). Pointes de flèches en (h') : neurites positifs à la calbindine. i, i' Image de projection maximale des piles Z immunocolorées pour Ku80 humain (vert), Recoverin (rouge) et PKCalpha (blanc) dans (i, i'). Notez que les cellules bipolaires humaines Ku80- et PKCalpha + étaient situées à proximité des photorécepteurs humains Ku80 + et Recoverin + (têtes de flèches). j, j' Image de projection maximale des piles Z colorées pour CtBP2 (vert), LRIT3 (rouge) et PKCalpha (blanc). Fort grossissement en (j'). Notez que les marqueurs photorécepteur-synapse CtBP2 et LRIT3 ont été exprimés près des neurites des cellules bipolaires en bâtonnet PKCalpha +. Coloration DAPI (bleu) en (a, a', b–b", c, d, e, e', f, g, g', h, i, j, j'). Barres d'échelle : 100 µm en ( a, a', b), 10 µm dans (b', b", c–j) et 1 µm dans (j'). Couche nucléaire interne INL, couche de cellules ganglionnaires GCL.

Nous avons en outre examiné la maturation des photorécepteurs greffés par l'expression de la tige, du cône, du segment externe (OS), de la couche plexiforme externe (OPL) et des marqueurs synaptiques. Les rosettes de photorécepteurs contenaient à la fois des photorécepteurs à tige S-arrestin + et des photorécepteurs à cône Cone-arrestin + (Fig. 6b, b ', b "). Les rosettes de photorécepteurs contenaient également des précurseurs de tige NRL +, des précurseurs de cône RXRG + et certains photorécepteurs de cône matures positifs pour S- opsine et L / M-opsine (Fig. 6c, c ', d).Les bâtonnets et les cônes des rosettes des photorécepteurs étaient positifs pour les marqueurs de phototransduction (GNAT1 et GNAT2) et les marqueurs OS (PRPH2 et PNA), indiquant que les bâtonnets et les cônes ont mûri pour former des structures de type OS (Fig. 6e, e ', f). Les neurites de synaptophysine + et les cellules horizontales de calbindine + résidaient autour des rosettes de photorécepteurs humains, indiquant que la structure de type OPL s'était formée (Fig. 6g, g ', g", h, h', pointes de flèches). Des images à plus fort grossissement ont montré que les photorécepteurs humains Recoverin + et Ku80 + étaient en contact direct avec les cellules bipolaires hôtes / rat PKCalpha + et Ku80− (Fig. 6i, i ', pointes de flèche). Nous avons également observé l'expression des marqueurs pré-synaptiques photorécepteurs CtBP2 (Ribeye) et LRIT3 aux extrémités des dendrites bipolaires PKCalpha + (Fig. 6j, j '). Ces résultats ont démontré que les feuilles rétiniennes préservées se sont greffées chez des rats immunodéficients sévères de modèle RD pour se différencier en photorécepteurs matures avec des structures de type OS et OPL.

Pour démontrer la réactivité à la lumière des feuilles rétiniennes, nous avons effectué des tests d'électrophysiologie ex vivo à l'aide d'un réseau multi-électrodes (MEA). Des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-S17 aux jours de différenciation 81 à 95 après la conservation de la RT pendant 3 jours ont été transplantées dans l'espace sous-rétinien de 12 rats RD-nus âgés de 20 à 30 semaines. Les yeux non transplantés ont été utilisés comme témoins appariés selon l'âge. Les rats ont été soumis à une analyse MEA ex vivo 8 à 9 mois après la transplantation pour évaluer le nombre de pointes dérivées des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) et les réponses lumineuses RGC comme décrit précédemment36,56. Des stimuli lumineux à trois intensités (faible, moyenne, forte) ont été appliqués et des enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés dans trois conditions : avant l'ajout du bloqueur du récepteur métabotropique du glutamate (mGluR6) L-AP4 (Avant), après l'ajout de L-AP4 (L- AP4), et après lavage de L-AP4 (après lavage) (Fig. 7a, b). La longueur de la zone greffée était d'environ 1,0 à 2,0 mm (Fig. 7b, ligne rouge). La zone greffée a été montée sur les électrodes. Les histogrammes de temps péri-stimulus du nombre de pics RGC suggéraient que des pics RGC induits par un stimulus lumineux étaient détectés dans la rétine transplantée (Fig. 7c, en haut). Dans un enregistrement représentatif (Fig. 7c, encadré et Fig. 7d), une augmentation du nombre de pics RGC a été observée après le début du stimulus lumineux (Fig. 7d, Avant). L'ajout de L-AP4 a atténué les pics RGC induits par le stimulus lumineux (Fig. 7c, d, L-AP4). Après lavage de L-AP4, les pointes RGC induites par un stimulus lumineux sont réapparues avec une réactivité accrue (Fig. 7d, après lavage). En revanche, peu de pics RGC induits par un stimulus lumineux ont été détectés dans les rétines témoins non transplantées (Fig. 7c, d, en bas). Ces résultats ont indiqué que les réponses lumineuses RGC dans les rétines de rat transplantées étaient dérivées des feuillets rétiniens humains greffés et dépendaient de la transmission synaptique des photorécepteurs greffés aux cellules bipolaires. Des réponses lumineuses RGC similaires étaient évidentes dans 2 des 13 yeux transplantés avec des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-Q après conservation par RT (Fig. 7a, b supplémentaires). Même les feuilles iPSC-rétiniennes transplantées après conservation par RT pendant 4 jours ont montré des réponses lumineuses RGC (et Fig. 7c, d supplémentaires).

un schéma d'essai d'électrophysiologie ex vivo utilisant MEA pour évaluer les réponses lumineuses dans les rétines iPSC transplantées. Des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-S17 ont été transplantées dans l'espace sous-rétinien chez des rats RD-nus. Des rétines de rat transplantées et non transplantées ont été montées sur les électrodes MEA pour l'enregistrement électrophysiologique. Au cours de l'enregistrement, des stimuli lumineux ont été effectués à différentes intensités (faible, moyenne, forte), et les rétines de rat ont été incubées dans le milieu d'Ames (Avant), suivies de l'ajout de L-AP4 (L-AP4) et du lavage de L -AP4 (Après lavage). b–d Résultats représentatifs de l'analyse MEA. ( b ) Image de contraste interférentiel différentiel (DIC) d'une rétine de rat RD-nude montée sur le MEA. La zone greffée était indiquée par une ligne pointillée rouge. Barre d'échelle : 1 mm. c, d Histogrammes de temps péri-stimulus pour examiner le nombre de pics RGC lors de stimuli lumineux intenses (12,84 log photons/cm2/s). L'axe X et l'axe Y représentent respectivement le temps et le nombre moyen de pics RGC. Les données d'enregistrement pour les rétines de rat transplantées sur feuille rétinienne dérivées d'iPSC-S17 (transplantées ; supérieures) et les rétines de rats non transplantées (non transplantées ; inférieures) dans les trois conditions (avant, L-AP4, après lavage) sont présentées. Les données d'enregistrement d'électrodes multiples sont présentées en (c) et les données représentatives (boîte rouge en c) sont présentées en (d). Boîte jaune en (c, d) : stimuli lumineux. Flèches rouges en (d) : démarrer la synchronisation des stimuli lumineux. e Probabilités de réponse lumineuse RGC. Des rétines de rat non transplantées témoins (témoin ; n = 12) et des rétines de rat transplantées sur feuille rétinienne dérivées d'iPSC-S17 (transplantées ; n = 12) ont été soumises à une analyse MEA pour évaluer les réponses RGC à la stimulation lumineuse. Les points et les barres montrent le résumé par échantillon (rétine de rat enregistrée) des données collectées. Point : probabilité de réponse à la lumière RGC estimée par modélisation statistique (inférence statistique bayésienne avec échantillonnage de chaîne de Markov Monte Carlo). Barre : intervalle de confiance à 89 %.

Pour confirmer davantage le potentiel fonctionnel des feuilles rétiniennes, nous avons comparé la probabilité de réponses lumineuses RGC dans les rétines non transplantées (contrôle) et transplantées. Le nombre de RGC avec des pics sensibles à la lumière par le nombre de RGC enregistrés (probabilité de réponse à la lumière RGC) a été estimé en utilisant l'inférence statistique bayésienne comme décrit56. Dans les rétines de rats non transplantés, des réponses lumineuses RGC robustes ont rarement été détectées pour les stimuli lumineux faibles, moyens et forts (Fig. 7e, Contrôle et Avant ; 0 réponses lumineuses dans 12 rétines de rat, 0 %). Dans les rétines de rat transplantées avec des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC-S17, des réponses lumineuses RGC robustes avec une probabilité de réponse moyenne> 0, 25 ont été observées dans deux rétines de rat pour des stimuli lumineux moyens à forts (Fig. 7e, Transplanté et avant; 2 réponses lumineuses dans 12 rétines de rat, 17 %). Les réponses lumineuses RGC détectées étaient principalement de type ON car elles montraient une atténuation en présence de L-AP4 (Fig. 7e, Transplanté et L-AP4) et réapparaissaient après le lavage de L-AP4 (Fig. 7e, Transplanté et Après lavage) . Notez que les réponses à la lumière RGC ont été améliorées après le lavage L-AP4 (Fig. 7e, Transplanté et après lavage contre transplanté et avant), conformément à l'étude précédente56. Après lavage L-AP4, des réponses lumineuses RGC ont été observées dans trois rétines transplantées pour un stimulus lumineux faible et six rétines transplantées pour des stimuli lumineux moyens à forts (Fig. 7e, Transplanté et Après lavage ; 6 réponses lumineuses dans 12 rétines de rat, 50 %). Ces résultats ont démontré que les feuilles iPSC-rétiniennes transplantées après conservation par RT présentaient des fonctions de réponse lumineuse RGC (6 réponses lumineuses dans 12 rétines de rats transplantées [50 %] contre 0 réponses lumineuses dans 12 rétines de rats témoins [0 %]) (Fig. 7e) .

Fait intéressant, des réponses lumineuses RGC ont été observées dans les feuillets rétiniens transplantés les jours de différenciation 81–83 (n = 7) et 90–95 (n = 5), indiquant que les feuillets rétiniens environ au jour 80 et environ au jour 90 avaient tous deux le potentiel de s'améliorer. réponses lumineuses chez les rats modèles de dégénérescence rétinienne et que la plage autorisée de jours de différenciation pour l'efficacité peut être large (Fig. 8a supplémentaire). De plus, des réponses lumineuses RGC dans les yeux transplantés ont été observées chez des rats nus RD mâles et femelles, ce qui indique que la greffe de feuille rétinienne améliorait les réponses lumineuses RGC chez les animaux mâles et femelles (Fig. 8b supplémentaire).

Prises ensemble, les études d'efficacité ont démontré que les feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC conservées à 17 ° C pendant 3 à 4 jours avaient le potentiel de se greffer et de mûrir dans les rétines de rat RD-nude gravement dégénérées pour présenter les fonctions de réponse à la lumière RGC mesurées par ex tests d'électrophysiologie in vivo. Ces études d'innocuité et d'efficacité sur les feuillets rétiniens ont démontré que les méthodes de conservation QC et RT étaient raisonnables pour la génération de feuillets rétiniens transplantables (Fig. 9 supplémentaire).

La technologie de culture de cellules souches auto-organisée permet la génération de tissus 3D et d'organoïdes dans une boîte1. La transplantation auto-organisée de tissus/organoïdes est une approche intéressante pour la médecine régénérative dans la dégénérescence rétinienne. Des études antérieures ont montré que des feuilles hPSC-rétiniennes ont été greffées pendant 0,5 à 2 ans chez les rongeurs modèles de dégénérescence des photorécepteurs en phase terminale et les primates non humains8,35,36,37,39,57. Les principales technologies restantes pour la transplantation de tissus/organoïdes étaient une stratégie de CQ et une méthode de conservation. Dans cette étude, nous avons développé une stratégie QC pour les feuilles rétiniennes dérivées de hPSC. Le tissu rétinien en culture forme lui-même une structure morphologique unique qui est facile à distinguer au microscope, et donc les feuilles rétiniennes peuvent être disséquées. Pour exclure d'éventuelles erreurs dans la sélection du tissu rétinien et éviter les tissus hors cible, nous avons caractérisé les principaux tissus hors cible et développé le test PCR en anneau. Le tissu rétinien avec sa grande structure neuroépithéliale continue peut être disséqué en deux feuilles de tissu : la feuille centrale interne (coiffe) et la feuille périphérique externe (anneau) avec des modèles d'expression génique similaires. Ainsi, l'analyse qPCR de l'anneau peut être utilisée pour estimer l'expression du gène dans la coiffe correspondante. Comme le test PCR en anneau nécessite 1 à 2 jours, nous avons développé la méthode de conservation RT pour stocker les feuilles rétiniennes pendant au moins 3 à 4 jours. Pour démontrer la justification de la stratégie QC et de la méthode de conservation par RT, nous avons réalisé des études de tumorigénicité in vivo et d'efficacité préclinique. Dans l'étude de tumorigénicité, aucune tumeur ou aucun autre effet indésirable lié aux feuillets rétiniens dérivés d'iPSC n'a été observé. L'étude d'efficacité préclinique a démontré que les feuillets rétiniens préservés avaient le potentiel de se greffer et de mûrir dans un état gravement dégénéré et présentaient des fonctions de réponse à la lumière mesurées par des tests d'électrophysiologie ex vivo. Ces études précliniques soutiennent le concept de greffe de feuillet rétinien dérivé d'iPSC pour la dégénérescence rétinienne.

Sur la base d'études actuelles et antérieures5,6,7,8,27,33,34,35,36,37,38,39, le Kobe City Eye Hospital a demandé une recherche clinique pour un nombre limité de patients utilisant des feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC pour rétinite pigmentaire. En juin 2020, le plan de recherche clinique a été approuvé par le Conseil des sciences de la santé du ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être du Japon, et la recherche clinique a commencé (ID d'essai : jRCTa050200027). Sumitomo Pharma a développé un processus de fabrication de qualité clinique et généré des feuilles rétiniennes allogéniques dérivées d'iPSC de qualité clinique. Des feuilles iPSC-rétiniennes ont été transplantées chez deux patients en 2020-2021.

La présente étude est basée sur une technologie de culture auto-organisée très efficace et robuste. La combinaison des méthodes SFEBq, BMP, de préconditionnement et d'inversion d'induction permet une culture de différenciation 3D auto-organisée robuste pour la génération de tissu rétinien avec un grand neuroépithélium7,8 continu. Cette grande structure continue de neuroépithélium avait une taille de 1 à 3 mm dans la direction tangentielle et était facile à distinguer au microscope, permettant de disséquer le capuchon et l'anneau. Le tissu rétinien auto-organisé avec un neuroépithélium continu se différencie de manière reproductible pour former une structure multicouche avec un précurseur de photorécepteur Crx + et des couches de cellules progénitrices rétiniennes Chx10 + à partir de plusieurs lignées hPSC en utilisant nos protocoles ou différents protocoles de culture6,12,13,14,18,19,22. Cette fonctionnalité d'auto-organisation 3D éventuellement basée sur le programme de développement embryonnaire intrinsèque est la technologie de base pour la génération robuste de feuilles rétiniennes avec une qualité contrôlée.

L'une des caractéristiques de la méthode QC dans la présente étude était la dissection et l'analyse de l'anneau pour vérifier la qualité de la coiffe. Cette approche cap-and-ring pourrait être utilisée pour d'autres organoïdes avec un épithélium continu tels que les organoïdes corticaux, hippocampiques, hypophysaires et intestinaux40,58,59,60. Bien que la dissection manuelle de minuscules tissus soit une procédure expérimentale répandue dans la recherche utilisant des embryons précoces de Xenopus ou des cerveaux en développement de souris pour la culture de cellules précurseurs neurales primaires33,39, l'automatisation et la mécanisation du processus de dissection seront importantes pour la fabrication future de feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC.

Pour examiner la qualité de l'anneau, un test QC candidat était l'analyse qPCR et les autres étaient l'analyse IHC, la cytométrie en flux, l'analyse par puce génétique (microarray), l'ARN-seq et l'analyse de cellule unique. Nous avons choisi la qPCR dans cette étude, car elle permet des tests à haut débit pour tester de nombreux échantillons dans une période relativement courte, a une sensibilité élevée et est techniquement facile48. Les autres tests QC avaient également des points forts. Une étude récente utilisant l'approche ARN-seq a révélé que les cellules hors cible Six6 négatives dans la culture de différenciation rétinienne utilisant la méthode Matrigel contiennent plusieurs cellules neurales, notamment des cellules positives pour Emx2 et des cellules positives pour HoxB261. De plus, les analyses de cellule unique telles que l'ARN-seq de cellule unique sont des technologies puissantes, et plusieurs groupes ont rapporté des études pionnières13,62,63,64,65. Pendant ce temps, les technologies d'imagerie et le traitement informatique des images, telles que les technologies d'apprentissage en profondeur, sont des approches prometteuses pour le développement de tests de CQ non destructifs. Dans les études futures, nous aimerions procéder à une analyse de cellule unique et à une technologie d'imagerie pour étudier plus avant la qualité des rétines 3D auto-organisées.

Bien que la cryoconservation soit une approche attrayante pour l'approvisionnement mondial, les feuillets rétiniens cryoconservés présentaient une prise de greffe altérée. Par conséquent, nous avons dû développer une méthode de conservation sans congélation et avons constaté que la température optimale pour la conservation de la feuille rétinienne était proche de la température ambiante (17 ± 5 ° C). La conservation de la température ambiante a été rapportée pour le tissu hépatique49, et notre étude a démontré que la température ambiante proche convenait aux tissus neuraux comme le tissu rétinien. Les basses températures autour de 4 °C ont causé des dommages aux tissus, probablement par un métabolisme intracellulaire anormal à 4 °C49. La culture à 37 ° C sous 5 % de CO2 était adaptée à la croissance cellulaire, mais la morphologie des feuillets rétiniens a changé au cours de la culture auto-organisée. La conservation par RT à 17 ± 5 °C pourrait maintenir la morphologie des feuillets rétiniens. Pendant la conservation par RT, le tissu rétinien s'est arrêté pour entrer en phase S, ce qui soulève la possibilité que la prolifération puisse s'arrêter dans cette condition de conservation. La conservation de la RT a récemment été rapportée pour l'EPR et le tissu rétinien66,67. Nous avons développé une méthode de conservation par RT et réalisé des études de transplantation, y compris une étude de tumorigénicité de 1,5 an, pour les feuillets rétiniens dans des conditions de conservation par RT.

Pour les applications cliniques, nous avons évalué la tumorigénicité in vivo et l'efficacité des feuilles iPSC-rétiniennes générées à l'aide du test PCR en anneau et de la méthode de conservation RT. Dans l'étude de tumorigénicité, aucune tumeur ou aucun autre effet indésirable lié aux feuillets rétiniens n'a été observé. Les feuilles iPSC-rétiniennes conservées par RT se sont greffées et ont mûri chez des rats RD-nus pour former des rosettes de photorécepteurs. Des structures de rosettes de photorécepteurs similaires ont été observées lors d'une greffe de tissu rétinien fœtal dérivé d'un donneur humain chez le rat68. Bien que la moitié des photorécepteurs iPSC humains dans les rosettes du côté RPE de l'hôte soient éloignés des cellules bipolaires hôte / rat, l'autre moitié des photorécepteurs iPSC humains dans les rosettes du côté RGC hôte pourraient entrer en contact avec les cellules bipolaires hôte / rat. Les photorécepteurs iPSC greffés in vivo ont mûri pour former la structure de type OS sur la surface apicale interne des rosettes et la structure de type OPL avec l'expression du marqueur synaptique photorécepteur dans la face basale externe adjacente aux cellules bipolaires et aux cellules horizontales. La microscopie électronique sera une clé pour démontrer les connexions synaptiques entre les photorécepteurs greffés et les cellules bipolaires hôtes. Il est important de noter que 50 % des greffes iPSC-rétiniennes ont présenté des réponses lumineuses contrôlées par des enregistrements MEA ex vivo. Ce taux était comparable aux résultats précédents pour la transplantation de rétines iPSC fraîches sans conservation par RT (4 réponses lumineuses dans 7 yeux de rat transplantés, 57 %)36. Ces observations ont démontré que les feuilles iPSC-rétiniennes conservées par RT transplantées dans l'état de dégénérescence rétinienne en phase terminale se sont greffées et se sont différenciées en photorécepteurs matures et ont présenté des réponses lumineuses RGC. Dans une étude future, il sera intéressant d'étudier la réactivité à la lumière des feuilles rétiniennes conservées par RT dans le cerveau et les niveaux de comportement37.

En vue de futures applications cliniques chez un grand nombre de patients, d'autres études précliniques seront essentielles. Parmi eux, les grandes études animales visant à développer des procédures chirurgicales, des dispositifs de transplantation et des protocoles d'immunosuppression sont importantes pour permettre une utilisation généralisée des feuilles rétiniennes. Basée sur la technologie de culture de cellules souches auto-organisées, la réalisation de la thérapie tissulaire/organoïde en médecine est en cours.

Deux lignées iPSC humaines, iPSC-LPF11 et iPSC-S17, ont été établies à partir de cellules sanguines périphériques à l'aide de vecteurs de virus Sendai par Sumitomo Pharma8. La lignée iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q) a été établie par le iPSC Stock Project organisé par le Kyoto University Center for iPS Cell Research and Application (CiRA) et fourni par l'Université de Kyoto69,70. La lignée iPSC-1231A3 établie à l'Université de Kyoto et dérivée d'ePBMC(R) acheté auprès de Cellular Technology Limited (http://www.immunospot.com/) a été fournie par l'Université de Kyoto41. Les protocoles expérimentaux utilisant des CSPi humains de qualité clinique ont été approuvés par le comité d'éthique de la recherche de Sumitomo Pharma Co., Ltd., Japon.

Les méthodes de culture hPSC sans alimentation, SFEBq, préconditionnement, d0-SAG, BMP et induction-inversion ont été réalisées comme décrit 6, 7, 8, 41 avec de légères modifications. Dans le processus 1 (culture de maintenance), les CSPi humaines ont été maintenues sur une matrice LM511-E8 (Nippi) dans un milieu StemFit (Ajinomoto) selon un protocole publié41 avec de légères modifications8. Le milieu a été changé tous les 1 à 2 jours jusqu'à ce que les cellules aient atteint 70 à 80 % de confluence. Les iPSC ont été passés à l'aide de l'enzyme TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) et dissociés en cellules individuelles par pipetage doux. Les CSPi dissociées ont été ensemencées à une densité de 700 à 1700 cellules/cm2 et cultivées dans des plaques de culture à six puits recouvertes de matrice LM511-E8 (Iwaki) contenant du milieu StemFit avec 10 µM Y-27632 (Wako)8. Avant la différenciation, les CSPi ont été traités avec du SB431542 (SB ; Wako) et/ou un agoniste lissé (SAG ; Enzo Biochem) comme étape de préconditionnement.

Dans le processus 2 (différenciation rétinienne), les hPSC ont été traités avec l'enzyme TrypLE Select à 37 ° C pendant 4 à 7 min et dissociés en cellules individuelles par pipetage doux. Les iPSC dissociés ont été rapidement réagrégés à l'aide de plaques à 96 puits à faible adhérence cellulaire avec des puits à fond en V (plaques Sumilon PrimeSurface; Sumitomo Bakelite) dans un milieu de différenciation (gfCDM + KSR) avec Y-27632 et SAG (méthode d0-SAG). Le milieu de différenciation était du gfCDM additionné de 10 % de KSR, tandis que le gfCDM seul comprenait 45 % de milieu de Dulbecco modifié par Iscove (Gibco), 45 % de Hams F12 (Gibco), Glutamax, 1 % de concentré de lipides chimiquement défini (Gibco) et 450 µM de monothioglycérol ( Sigma-Aldrich). Le jour d'initiation de la culture de SFEBq a été défini comme le jour 0. Au jour 3, de la BMP4 humaine recombinante (R&D Systems) a été ajoutée à 1,5 nM (55 ng/ml)7. Par la suite, le milieu de culture a été changé tous les 3 à 4 jours pour générer du tissu rétinien immature.

Dans le processus 3 (culture d'induction-inversion), le tissu rétinien immature généré à partir des CSPi a été soumis à une culture d'induction-inversion en deux étapes comme suit. Pour la culture d'induction, les agrégats cellulaires des jours 14 à 18 ont été transférés de plaques à 96 puits dans des boîtes de Pétri non adhésives de 90 mm (Sumitomo Bakelite ; environ 32 à 48 agrégats/boîte de 90 mm) et cultivés pendant 3 jours dans un milieu DMEM/F12-Glutamax (Gibco) contenant 1 % de supplément de N2 (Gibco), 3 µM de CHIR99021 (inhibiteur de GSK3 ; Wako) et 5 µM de SU5402 (inhibiteur de FGFR ; Wako). Pour la culture d'inversion (processus 3) et la culture de maturation (processus 4), les agrégats cellulaires ont été cultivés dans un milieu de maturation de la rétine comme décrit (Nukaya et al. WO2019017492A1, WO2019054514A1). Le milieu a été changé tous les trois ou quatre jours pour obtenir des rétines 3D. Les agrégats de cellules flottantes ont été analysés à l'aide d'un microscope inversé (Keyence BZ-X810, Nikon Eclipse-Ti ou Olympus IX83).

Chaque agrégat cellulaire contenant du tissu neuroépithélial stratifié continu a été soumis à une dissection du capuchon et de l'anneau (processus 5). La partie centrale du tissu neuroépithélial a été coupée de l'agrégat cellulaire sous un microscope comme décrit39. La feuille de tissu neuroépithélial interne-central disséquée a été recueillie comme capuchon. Dans le même temps, la partie périphérique externe environnante du tissu neuroépithélial a été coupée de l'agrégat de cellules et récoltée sous forme d'anneau. Les bouchons et anneaux obtenus ont été soumis à la méthode de conservation RT et au test ring-qPCR, respectivement. Les coiffes dont les anneaux ont réussi le test PCR en anneau ont été utilisées comme feuillets rétiniens pour la transplantation.

Les anneaux et autres échantillons de tissus ont été lysés avec du tampon RLT (Qiagen) contenant 1 % de 2-mercaptoéthanol, et l'ARN total a été extrait et purifié à l'aide d'un kit RNeasy Micro (Qiagen). L'ARN total a été rétrotranscrit et soumis à une qPCR à l'aide d'un système de PCR en temps réel StepOne Plus (Applied Biosystems) ou Biomark HD (Fluidigm) conformément aux instructions du fabricant. Sur la base des valeurs Ct pour chaque gène, les scores Z ont été calculés pour les capuchons ou anneaux individuels. Les données ont été visualisées sous forme de cartes thermiques à l'aide de la fonction heatmap.2 du package R/Bioconductor gplots. L'ACP a été effectuée à l'aide de la fonction prcomp dans le package de base R. Les résultats de l'ACP ont été visualisés à l'aide du package R ggplot2. Les amorces qPCR suivantes (sondes TaqMan) ont été achetées auprès d'Applied Biosystems, Inc. et utilisées pour l'analyse qPCR : GAPDH (Hs02758991_g1), ACTB (Hs01060665_g1), Sox2 (Hs01053049_s1), Pax6 (Hs00240871_m1), Rx (Hs00429459_m1), Chx 10 (Hs01584047_m1 ), Recoverin (Hs00610056_m1), Blimp1 (Hs00153357_m1), NRL (Hs00172997_m1), Crx (Hs00230899_m1), MITF (Hs01117294_m1), Aqp1 (Hs01028916_m1), Emx2 (Hs0024457 4_m1), HoxB2 (Hs01911167_s1) et Lin28a (Hs00702808_s1).

Les tissus disséqués dans les agrégats cellulaires ont été lysés avec du tampon RLT (Qiagen) contenant 1 % de 2-mercaptoéthanol, et l'ARN total a été extrait et purifié à l'aide d'un kit RNeasy Micro (Qiagen). L'analyse par microréseau à l'aide d'un réseau GeneChip a été réalisée par Kurabo Industries (Osaka, Japon). En bref, l'ARN total a été rétrotranscrit en ADNc avec l'amorce T7 oligo d(T) (Affymetrix). Ensuite, l'ARNc marqué à la biotine a été synthétisé et amplifié par transcription in vitro de la matrice d'ADNc du deuxième brin à l'aide de l'ARN polymérase T7 (Affymetrix). L'ARNc marqué a été purifié et fragmenté, chargé sur une puce GeneChip® Human Genome U133 Plus2.0 (Affymetrix) et hybridé selon le protocole du fabricant. Les données d'intensité brutes du réseau GeneChip ont été analysées à l'aide du logiciel d'exploitation GeneChip (Affymetrix). Les données ont été transformées de manière logarithmique et logFC a été calculé pour chaque gène. Les données logFC ont été visualisées sous forme de cartes thermiques à l'aide de la fonction heatmap.2 du package R/Bioconductor gplots.

Les coiffes et les anneaux ont été disséqués des rétines 3D. Le bouchon dont l'anneau a réussi le test ring-PCR a été soumis à une analyse scPCR. Le capuchon a été dissocié en cellules individuelles à l'aide de papaïne (Wako), puis chargé dans le préampli C1 IFC (10–17 μm, Fluidigm) pour l'isolement d'une seule cellule. La pré-amplification des gènes a été réalisée dans l'instrument C1 (Fluidigm) selon les instructions du fabricant. Les ADNc préamplifiés de chaque cellule ont été encore amplifiés en utilisant l'instrument Biomark HD (Fluidigm) avec les tests TaqMan.

Les agrégats cellulaires et les feuilles de tissu (bouchons) ont été transférés dans des tubes de 1,5 ml ou 15 ml. Après lavage du surnageant de culture, une solution de conservation a été ajoutée et les tubes ont été placés dans des incubateurs réglés à 4, 12, 15, 17, 20, 22 et 37 °C. Pour la validation de la température, les températures des incubateurs ont été surveillées par des enregistreurs de température dans certaines expériences. Comme solutions de conservation candidates, Optisol-GS (Bausch & Lomb), une solution saline équilibrée (BSS) (Gibco), la solution de stockage à froid Belzer UW (Bridge to Life) et des milieux de culture cellulaire ont été utilisés. Pour la conservation à température ambiante des bouchons, chaque tube de 1,5 ml contenant un bouchon dans Optisol a été placé dans un incubateur froid (Mitsubishi Electric Engineering) réglé à 17 ° C. Les bouchons qui ont réussi les tests de CQ, y compris le test PCR en anneau, ont été récupérés et utilisés pour la transplantation.

Des feuilles de tissu qui ont été disséquées à partir de rétines 3D ont été dissociées en cellules individuelles en utilisant de la papaïne (Wako). Après centrifugation et élimination des surnageants, les cellules dissociées ont été mises en suspension dans du milieu frais. Les cellules totales et les cellules mortes ont été colorées par l'orange d'acridine et le DAPI, et le nombre et le pourcentage de cellules viables ont été déterminés en utilisant le NucleoCounter® NC-200 (ChemoMetec).

Tous les protocoles expérimentaux sur les animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux du RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research (BDR) et ont été menés conformément à l'Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Des rats SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav nude (rats RD-nude) ont été obtenus auprès du Rat Resource and Research Center54,55. La transplantation dans l'espace sous-rétinien des rats a été réalisée comme décrit36. Des rats nus RD mâles et femelles transplantés avec des feuilles iPSC-rétiniennes ont été utilisés pour les enregistrements MEA à l'âge de 13, 5 à 15 mois (c'est-à-dire 8 à 10, 5 mois après la transplantation). Les enregistrements MEA ont été effectués à l'aide du système USB-MEA60-Up (systèmes multicanaux) comme décrit36,56. En bref, les rats RD-nus ont été adaptés à l'obscurité pendant 1 à 3 jours avant utilisation. Les rats ont été anesthésiés et sacrifiés par inhalation excessive d'isoflurane ou de sévoflurane. Leurs œilletons ont ensuite été récoltés sous une faible lumière rouge avec une longueur d'onde culminant à 700 nm et placés dans le milieu d'Ames oxygéné (Sigma-Aldrich) dans l'obscurité. La rétine a été soigneusement isolée de l'œilleton et le vitré résiduel a été retiré. La rétine a été montée avec le côté RGC vers le bas. La zone greffée se reconnaissait à son aspect pointillé et centrée sur l'électrode. Des stimuli lumineux plein champ d'une durée de 10 ms et 1 s à différentes intensités (faible : 10,56 log photons/cm2/s ; moyen : 12,16 log photons/cm2/s ; fort : 12,84 log photons/cm2/s) ont été générés à l'aide d'un DEL blanche (NSPW500C; Nichia Corp.). Chaque série de stimulation, composée de 3 répétitions pour chaque combinaison d'intensité et de durée de stimulation, a été répétée avant l'ajout de L-AP4 (Before), en présence de 10 μM de L-AP4 (L-AP4, mGluR6 blocker, Wako), et après lavage de L-AP4 (Après lavage). Des stimuli super puissants (15,48 log photons/cm2/s) ont été appliqués à la fin des enregistrements MEA pour confirmer la viabilité cellulaire dans les rétines. Les données MEA ont été recueillies à une fréquence d'échantillonnage de 20 kHz sans filtrage. Les pointes enregistrées ont été triées hors ligne pour compter les pointes RGC à l'aide de la formation automatique de modèles et de l'algorithme d'appariement des pointes dans Spike 2 (version 7.2 ; CED) avec des modifications mineures56. Les réponses lumineuses RGC ont été définies comme ayant une augmentation de 2 fois de la fréquence de pointe par rapport au début et/ou au décalage de la stimulation. Le nombre moyen de pics RGC et la probabilité moyenne de réponse lumineuse RGC (nombre de RGC avec des pointes sensibles à la lumière par nombre de RGC enregistrés) ont été calculés à partir de tous les RGC détectés dans chaque échantillon, comme décrit36,56.

L'étude de tumorigénicité in vivo utilisant des animaux a été approuvée par l'IRB de la Fondation pour la recherche biomédicale et l'innovation (FBRI), le Comité pour les expérimentations animales du FBRI et le comité de protection des animaux du RIKEN BDR. La transplantation sous-rétinienne a été réalisée au RIKEN BDR. Des rats nus femelles ont été utilisés dans cette étude pour réduire les bagarres entre rats élevés dans une même cage71. Des rats nude femelles âgés de six semaines (rats F344/NJcl-rnu/rnu ; CLEA Japon) ont été utilisés pour la transplantation et ont subi des observations de l'état général et des mesures de poids pendant la période d'observation. Le stress chirurgical de la transplantation sous-rétinienne chez le rat a été évalué dans les yeux opérés de manière fictive (Fig. 5e, f supplémentaires). L'imagerie du fond d'œil et l'analyse OCT ont été réalisées à l'aide de RS-3000 Advance (Nidek) et Micron IV et OCT (laboratoires de recherche Phoenix) conformément aux instructions des fabricants. Après autopsie, les globes oculaires ont été fixés à 4 ° C dans SUPERFIX (KY-500; Kurabo Japon), inclus dans de la paraffine et tranchés avec un microtome à 3 µm d'épaisseur. Une section sur cinq a été utilisée pour la coloration HE et l'analyse histopathologique, et les autres sections ont été utilisées pour l'immunohistochimie.

L'IHC a été réalisée comme décrit8. Les agrégats cellulaires et les rétines transplantées récoltées à partir de rats RD-nus ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4% (Wako) et sectionnés avec un cryostat (Leica) pour préparer des coupes congelées. Les sections congelées et les sections de paraffine ont été traitées avec ou sans récupération d'antigène à base de chaleur dans une solution de récupération de cible (Dako) à 105 ° C pendant 15 min. Les principaux anticorps utilisés étaient les suivants : anti-Chx10 (mouton ; 1:500 ; Exalpha), anti-Pax6 (souris ; 1:1000 ; BD Biosciences), anti-Rx (cochon d'Inde ; 1:2000 ; Takara), anti -Crx (lapin ; 1:200 ; Takara), anti-Recoverin (lapin ; 1:500 ; Proteintech), anti-RXRG (souris ; 1:500 ; Santa Cruz Biotechnology), anti-NRL (chèvre ; 1:500 ; R&D Systems), anti-Lhx2 (lapin ; 1:500 ; Millipore), anti-Rhodopsin (souris ; 1:1000 ; Sigma Aldrich), anti-S-opsin (chèvre ; 1:1000 ; Santa Cruz Biotechnology), anti- S-opsin (lapin ; 1:500 ; Santa Cruz Biotechnology), anti-L/M-opsin (lapin ; 1:500 ; Millipore), anti-Cone-arrestin (Arrestin-3 ; chèvre ; 1:500 ; Novus) , anti-S-arrestine (souris ; 1:500 ; Novus), anti-CtBP2 (souris ; 1:500 ; BD Biosciences), anti-PKCalpha (chèvre ; 1:500 ; R&D Systems), anti-Ki67 (souris ; 1:500 ; BD Biosciences), anti-Aqp1 (Aquaporin1 ; lapin ; 1:500 ; Millipore), anti-Emx2 (mouton ; 1:100 ; R&D Systems), anti-caspase-3 clivée (lapin ; 1:200 ; Cell Signaling Technology), anti-HuNu (souris ; 1:500 ; Millipore), anti-humain Ku80 (lapin ; 1:500 ; Cell Signaling Technology), anti-humain Ku80 (chèvre ; 1:500 ; R&D Systems), anti-Gnat1 (lapin ; 1:500 ; Santa Cruz Biotechnology), anti-Gnat2 (lapin ; 1:500 ; Santa Cruz Biotechnology), anti-PRPH2 (souris ; 1:500 ; Millipore), agglutinine d'arachide (PNA) (1:500 ; Thermo Fisher Scientific), anti-Synaptophysine (chèvre ; 1:500 ; R&D Systems) et anti-LRIT3 (lapin ; 1 :500 ; Novus). La contre-coloration nucléaire a été réalisée avec du DAPI (Nacalai). Les coupes colorées ont été analysées avec un microscope à fluorescence (Keyence BZ-X810) ou un microscope confocal à balayage laser (Olympus Fluoview FV1000D, Leica TCS SP-8 ou Carl Zeiss LSM880). Les analyses d'images ont été effectuées avec les logiciels d'imagerie IMARIS (Oxford Instruments), ImageJ (National Institutes of Health) et Zen Blue (Carl Zeiss).

Pour le marquage EdU, rétines témoins avant conservation (j70+0), rétines conservées en Optisol à 17°C pendant 2 jours (j70+2) et 4 jours (j70+4), et rétines récupérées en culture à 37°C pendant 3 jours (j70 + 4 + 3) et 7 jours (j70 + 4 + 7) ont été traités avec l'analogue de la thymidine EdU pendant 4 h. Les rétines traitées par EdU ont été fixées et sectionnées avec un cryostat (Leica). Des sections des rétines ont été colorées avec de l'azoture marqué Alexa Fluor 488 (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. Les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope laser confocal et le nombre de cellules EdU-positives et de noyaux DAPI-positifs a été compté à l'aide du logiciel ImageJ (National Institutes of Health).

Les analyses statistiques ont été réalisées avec R version 3.6.0 (The R Foundation for Statistical Computing). Un test t de Student bilatéral a été effectué pour les comparaisons à deux groupes, et une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test de Tukey a été effectuée pour les comparaisons à plusieurs groupes. Les différences intergroupes de poids corporel et de taux de survie ont été testées par ANOVA unidirectionnelle et le test du log-rank, respectivement.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les demandes raisonnables seront rapidement examinées par les auteurs principaux afin de déterminer si la demande est soumise à des obligations de propriété intellectuelle ou de confidentialité. Cette étude n'a pas généré de nouvelles lignées cellulaires. Les données sources des graphiques sont fournies en tant que données supplémentaires. Les données du transcriptome des puces à ADN sont disponibles avec le numéro d'accession GSE197446.

Sasai, Y. Médecine régénérative de nouvelle génération : organogenèse à partir de cellules souches en culture 3D. Cellule souche cellulaire 12, 520–530 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kawasaki, H. et al. Génération de neurones dopaminergiques et d'épithéliums pigmentés à partir de cellules ES de primates par une activité inductrice dérivée des cellules stromales. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 99, 1580-1585 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ikeda, H. et al. Génération de précurseurs rétiniens neuronaux Rx+/Pax6+ à partir de cellules souches embryonnaires. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 102, 11331–11336 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osakada, F. et al. Vers la génération de photorécepteurs en bâtonnets et cônes à partir de cellules souches embryonnaires de souris, de singe et d'humain. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Eiraku, M. et al. Morphogenèse auto-organisatrice de la cupule optique en culture tridimensionnelle. Nature 472, 51–56 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nakano, T. et al. Auto-formation de coupes optiques et de rétine neurale stratifiée stockable à partir d'ESC humaines. Cellule souche cellulaire 10, 771–785 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kuwahara, A. et al. Génération d'une niche de cellules souches de type marge ciliaire à partir de tissu rétinien humain auto-organisé. Nat. Commun. 6, 6286 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kuwahara, A. et al. Le préconditionnement de l'état initial des cellules souches pluripotentes humaines sans chargeur favorise l'autoformation du tissu rétinien tridimensionnel. Sci. 9, 18936 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamba, DA, Karl, MO, Ware, CB & Reh, TA Génération efficace de cellules progénitrices rétiniennes à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 103, 12769–12774 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamba, DA, Gust, J. & Reh, TA La transplantation de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines restaure une certaine fonction visuelle chez les souris déficientes en Crx. Cellule souche cellulaire 4, 73–79 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, JS et al. Modélisation du développement précoce de la rétine avec des cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 106, 16698–16703 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, JS et al. Les structures de type vésicule optique dérivées de cellules souches pluripotentes humaines facilitent une approche personnalisée du traitement des maladies rétiniennes. Cellules souches 29, 1206-1218 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Capowski, EE et al. Reproductibilité et mise en scène d'organoïdes rétiniens humains 3D sur plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes. Développement 146, dev171686 (2019).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhong, X. et al. Génération de tissu rétinien tridimensionnel avec des photorécepteurs fonctionnels à partir d'iPSC humains. Nat. Commun. 5, 4047 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wahlin, KJ et al. Structures de type segment externe photorécepteur dans les rétines 3D à long terme de cellules souches pluripotentes humaines. Sci. Rep. 7, 766 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Boucherie, C. et al. Bref rapport : le neuroépithélium auto-organisé des cellules souches pluripotentes humaines facilite la dérivation des photorécepteurs. Cellules souches 31, 408–414 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gonzalez-Cordero, A. et al. Les précurseurs de photorécepteurs dérivés de cultures de cellules souches embryonnaires tridimensionnelles s'intègrent et mûrissent dans la rétine dégénérée adulte. Nat. Biotechnol. 31, 741–747 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gonzalez-Cordero, A. et al. La récapitulation du développement rétinien humain à partir de cellules souches pluripotentes humaines génère des populations transplantables de photorécepteurs à cône. Stem Cell Rep. 9, 820–837 (2017).

Article Google Scholar

Reichman, S. et al. Des cellules iPS humaines confluentes à la rétine neurale autoformée et à l'épithélium pigmenté rétinien. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 111, 8518–8523 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reichman, S. et al. Génération d'organoïdes rétiniens stockables et d'épithélium pigmenté rétinien à partir de cellules iPS humaines adhérentes dans des conditions sans xéno et sans alimentation. Cellules souches 35, 1176-1188 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mellough, CB, Sernagor, E., Moreno-Gimeno, I., Steel, DHW et Lako, M. Différenciation efficace spécifique au stade des cellules souches pluripotentes humaines vers les cellules photoréceptrices rétiniennes. Cellules souches 30, 673–686 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mellow, CB et al. La signalisation IGF-1 joue un rôle important dans la formation de la rétine neurale laminée tridimensionnelle et d'autres structures oculaires à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Cellules souches 33, 2416–2430 (2015).

Article PubMed Google Scholar

Seiler, MJ & Aramant, RB Remplacement cellulaire et restauration visuelle par greffes de feuillets rétiniens. Programme. Retin Eye Res 31, 661–687 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Llonch, S., Carido, M. & Ader, M. Technologie organoïde pour la réparation rétinienne. Dév. Biol. 433, 132–143 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gagliardi, G., Ben M'Barek, K. & Goureau, O. Remplacement des cellules photoréceptrices dans la dégénérescence maculaire et la rétinite pigmentaire : une approche basée sur les cellules souches pluripotentes. Programme. Retin Eye Res. 71, 1–25 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Ribeiro, J. et al. Restauration de la fonction visuelle dans une maladie avancée après transplantation de photorécepteurs de cônes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines purifiées. Cell Rep. 35, 109022 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Radtke, ND et al. Amélioration de la vision chez les patients atteints de dégénérescence rétinienne par l'implantation de la rétine avec l'épithélium pigmentaire rétinien. Suis. J. Ophtalmol. 146, 172-182 (2008).

Article PubMed Google Scholar

MacLaren, RE et al. Réparation rétinienne par transplantation de précurseurs de photorécepteurs. Nature 444, 203-207 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pearson, RA et al. Restauration de la vision après transplantation de photorécepteurs. Nature 485, 99-103 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nickerson, PEB, Ortin-Martinez, A. & Wallace, VA Échange de matériel dans la transplantation de photorécepteurs : mise à jour de notre compréhension de la communication donneur/hôte et de l'avenir de la science de la greffe cellulaire. Devant. Circuits neuronaux 12, 17 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, J., Cifuentes, H., Reynolds, J. & Lamba, DA L'immunosuppression via la perte d'IL2rgamma améliore l'intégration fonctionnelle à long terme des photorécepteurs dérivés de CSEh dans la rétine de la souris. Cellule souche cellulaire 20, 374–384.e5 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gagliardi, G. et al. Caractérisation et transplantation de photorécepteurs CD73 positifs isolés à partir d'organoïdes rétiniens dérivés d'iPSC humains. Stem Cell Rep. 11, 665–680 (2018).

Article CAS Google Scholar

Assawachananont, J. et al. Transplantation de feuilles rétiniennes 3D dérivées de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites chez des souris dégénératives rétiniennes. Stem Cell Rep. 2, 662–674 (2014).

Article Google Scholar

Mandai, M. et al. Les greffes de rétine dérivées d'iPSC améliorent la vision chez les souris en phase terminale de dégénérescence rétinienne rd1. Stem Cell Rep. 8, 69–83 (2017).

Article Google Scholar

Iraha, S. et al. Établissement de souris modèles de dégénérescence rétinienne immunodéficientes et maturation fonctionnelle de feuilles rétiniennes dérivées d'ESC humaines après transplantation. Stem Cell Rep. 10, 1059–1074 (2018).

Article CAS Google Scholar

Tu, HY et al. Survie à moyen et long terme et examen fonctionnel des rétines humaines dérivées d'iPSC dans des modèles de dégénérescence rétinienne chez le rat et le primate. EBioMedicine 39, 562–574 (2019).

Article PubMed Google Scholar

McLelland, BT et al. Les feuilles d'organoïdes de la rétine dérivées de CSEh transplantées différencient, intègrent et améliorent la fonction visuelle chez les rats dégénérés de la rétine. Investissez dans l'ophtalmol. Vis. Sci. 59, 2586-2603 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamasaki, S. et al. Faible immunogénicité et propriétés immunosuppressives des rétines humaines dérivées d'ESC et d'iPSC. Stem Cell Rep. 16, 851–867 (2021).

Article CAS Google Scholar

Shirai, H. et al. Transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans deux modèles primates de dégénérescence rétinienne. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 113, E81–E90 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Eiraku, M. et al. Formation auto-organisée de tissus corticaux polarisés à partir des CSE et sa manipulation active par des signaux extrinsèques. Cellule souche cellulaire 3, 519–532 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nakagawa, M. et al. Un nouveau système de culture efficace sans alimentation pour la dérivation de cellules souches pluripotentes induites humaines. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Miyazaki, T. et al. Les fragments de laminine E8 favorisent une adhésion et une expansion efficaces des cellules souches pluripotentes humaines dissociées. Nat. Commun. 3, 1236 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Hamann, S. et al. Aquaporines dans les tissus complexes : distribution des aquaporines 1-5 dans l'œil humain et de rat. Suis. J. Physiol. 274, C1332–C1345 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Stamer, WD, Bok, D., Hu, J., Jaffe, GJ & McKay, BS Canaux de l'aquaporine-1 dans l'épithélium pigmentaire rétinien humain : rôle dans le mouvement transépithélial de l'eau. Investissez dans l'ophtalmol. Vis. Sci. 44, 2803–2808 (2003).

Article PubMed Google Scholar

Theil, T., Aydin, S., Koch, S., Grotewold, L. & Rüther, U. La signalisation Wnt et Bmp régulent de manière coopérative l'expression graduée d'Emx2 dans le télencéphale dorsal. Développement 129, 3045–3054 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, CE et Krumlauf, R. Les défauts neuronaux dans le cerveau postérieur des mutants Hoxa1, Hoxb1 et Hoxb2 reflètent les interactions régulatrices entre ces gènes Hox. Développement 130, 5663–5679 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhai, J., Lin, H., Canete-Soler, R. & Schlaepfer, WW HoxB2 lie le mutant SOD1 et est modifié dans le modèle transgénique de la SLA. Hum. Mol. Genet. 14, 2629-2640 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kuroda, T. et al. Méthodes in vitro hautement sensibles pour la détection de cellules indifférenciées résiduelles dans des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules iPS humaines. PLoS One 7, e37342 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ishikawa, J. et al. Effets de la température hypothermique sur la survie et la restauration des organes. Sci. Rep. 5, 9563 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nahar, S. et al. Une comparaison de la préservation des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris à l'aide de la solution de l'université du Wisconsin et de la solution saline équilibrée de Hank. Cellules souches Int. 2018, 1625464 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Moyens, TL et al. L'épithélium cornéen après stockage optisol-GS. Cornée 15, 599–605 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kanemura, H. et al. Études de tumorigénicité de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) dérivé de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. PLoS One 9, e85336 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugai, K. et al. Premier essai clinique sur l'homme de la transplantation de NS / PC dérivés d'iPSC dans les lésions subaiguës complètes de la moelle épinière : protocole d'étude. Régén. Là. 18, 321–333 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sagdullaev, BT, Aramant, RB, Seiler, MJ, Woch, G. & McCall, MA Récupération induite par la transplantation rétinienne de la fonction visuelle rétinotectale dans un modèle de rongeur de rétinite pigmentaire. Investissez dans l'ophtalmol. Vis. Sci. 44, 1686–1695 (2003).

Article PubMed Google Scholar

Seiler, MJ et al. Une nouvelle souche de rat dégénéré de la rétine pigmentée immunodéficiente pour étudier la transplantation de cellules humaines sans immunosuppression. Arc Graefes. Clin. Exp. Ophtalmol. 252, 1079-1092 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama, T. et al. Greffes rétiniennes dérivées de cellules souches génétiquement modifiées pour une reconstruction rétinienne améliorée après la transplantation. iScience 24, 102866 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, B. et al. Les greffes d'organoïdes de la rétine développent des photorécepteurs et améliorent la fonction visuelle chez les rats RCS présentant un dysfonctionnement de l'EPR. Investissez dans l'ophtalmol. Vis. Sci. 61, 34 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, T. et al. Les cellules souches Lgr5 simples construisent des structures crypt-villositaires in vitro sans niche mésenchymateuse. Nature 459, 262-265 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Suga, H. et al. Autoformation d'une adénohypophyse fonctionnelle en culture tridimensionnelle. Nature 480, 57–62 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sakaguchi, H. et al. Génération de neurones hippocampiques fonctionnels à partir de tissu télencéphalique dorsomédian dérivé de cellules souches embryonnaires humaines auto-organisées. Nat. Commun. 6, 8896 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wahlin, KJ et al. Les reporters SIX6 et POU4F2 générés par CRISPR permettent d'identifier les différences transcriptionnelles cérébrales et optiques dans les organoïdes humains dérivés de PSC. Devant. Cellule Dév. Biol. 9, 764725 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Phillips, MJ et al. Une nouvelle approche de l'analyse de la séquence d'ARN d'une seule cellule facilite la déclaration des gènes in silico des types de cellules rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes humaines. Cellules souches 36, 313–324 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Collin, J. et al. Déconstruction des organoïdes rétiniens : l'ARN-Seq unicellulaire révèle les composants cellulaires de la rétine dérivée de cellules souches pluripotentes humaines. Cellules souches 37, 593–598 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cowan, CS et al. Types de cellules de la rétine humaine et de ses organoïdes à résolution unicellulaire. Cellule 182, 1623–1640.e1634 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sridhar, A. et al. Comparaison transcriptomique unicellulaire de la rétine fœtale humaine, des organoïdes rétiniens dérivés de hpsc et des cultures rétiniennes à long terme. Cell Rep. 30, 1644–1659.e1644 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kitahata, S. et al. Effets de fonctionnalité critiques de la température de stockage sur les suspensions de cellules d'épithélium pigmentaire rétinien induites par des cellules souches pluripotentes humaines. Sci. Rep. 9, 2891 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Georgiou, M. et al. L'expédition à température ambiante n'affecte pas l'activité biologique des organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes. PLoS One 15, e0233860 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, B., McLelland, BT, Mathur, A., Aramant, RB et Seiler, MJ Des feuilles de greffes de progéniteurs rétiniens humains améliorent la vision chez les rats atteints de dégénérescence rétinienne sévère. Exp. Oeil Rés. 174, 13-28 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoshida, S. et al. Une haplobanque HLA de qualité clinique de cellules souches pluripotentes induites humaines correspondant à environ 40 % de la population japonaise. Médecine 4, 51–66.e10 (2023).

Article CAS Google Scholar

Doi, D. et al. Étude préclinique de cellules progénitrices dopaminergiques dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour la maladie de Parkinson. Nat. Commun. 11, 3369 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamata, S., Kanemura, H., Sakai, N., Takahashi, M. & Go, MJ Conception d'un test de tumorigénicité pour les produits cellulaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). J.Clin. Méd. 4, 159-171 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous sommes reconnaissants à la CiRA (Kyoto, Japon) et à la Fondation CiRA (Kyoto, Japon) d'avoir aimablement fourni les iPSC. Nous remercions le Dr Mototsugu Eiraku pour ses conseils sur la culture de la maturation rétinienne, et Yasushi Hiramine, Miki Iwata, Kazunari Tanaka, Masahiro Yahata, Koichiro Manabe, Kiyoko Bando, Jiro Akimaru, Keigo Kawabe, Kenji Yoshida, Satoshi Ando, ​​Atsushi Tsuchida, Tomokazu Nagano, et les membres du RACMO pour des discussions fructueuses. Nous remercions Ayumi Kiso pour les études in vivo, Kohei Kanata pour la coloration IHC et Yukiko Ishigami pour la dissection. A.Ku. aimerait exprimer sa profonde gratitude à son regretté mentor, le Dr Yoshiki Sasai, un scientifique doué qui a été le pionnier de la biologie des cellules souches auto-organisées. Ce travail a été soutenu par le réseau de centres de recherche pour la réalisation de la médecine régénérative de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (MT, SK).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Kenji Watari, Suguru Yamasaki.

Médecine régénérative et cellulaire Kobe Center, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japon

Kenji Watari, Suguru Yamasaki, Tatsuya Kamei, Yasuyuki Kita, Masayo Fujiwara, Yoriko Hori, Anna Tanabe, Rina Hirai, Orie Terai, Osamu Ohno, Hidetaka Ohara, Tetsuya Hayama, Atsushi Ikeda, Daiki Nukaya, Keizo Matsushita, Akiyoshi Kishino, Toru Kimura & Atsushi Kuwahara

Laboratoire de régénération rétinienne, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japon

Suguru Yamasaki, Hung-Ya Tu, Chikako Morinaga, Take Matsuyama, Junki Sho, Keizo Matsushita, Masayo Takahashi et Michiko Mandai

Centre de recherche et de développement pour la thérapie cellulaire, Fondation pour la recherche biomédicale et l'innovation à Kobe, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japon

Masayuki Shikamura, Miyuki Nakamura et Shin Kawamata

Unité de recherche préclinique, Division de la recherche, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Konohana-ku, Osaka, 554-0022, Japon

Hideki Adachi & Tomoaki Tochitani

Division de la recherche et du développement technologiques, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japon

Aya Nakamura, Kazuki Ueyama et Keiichi Ono

Programme RIKEN pour la découverte de médicaments et les plateformes de technologie médicale, RIKEN Cluster for Science, Technology and Innovation Hub., Saitama, 351-0198, Japon

Chikako Morinaga & Michiko Mandai

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KW a conçu l'étude pour l'analyse des tissus hors cible, le test PCR en anneau et la méthode de conservation RT, a réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. SY a conçu l'étude pour la culture auto-organisée et l'analyse IHC in vivo, a réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. HYT a conçu et réalisé un test d'électrophysiologie, analysé des données et rédigé le manuscrit. MS, T.Ka., HA, TT, YK ont conçu et réalisé une étude de tumorigénicité, analysé les données et rédigé le manuscrit. AN, KU, KO, CM, TM, JS, MN, OT, OO, MF, YH, AT, RH, HO, TH, DN, KM ont réalisé des expériences et analysé des données. AI, MT, A.Ki., T.Ki. géré le projet et analysé les données. SK a supervisé et conçu une étude de tumorigénicité in vivo, analysé les données et rédigé le manuscrit. MM a conçu, supervisé et conçu une étude d'efficacité in vivo, réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. A.Ku. conçu, supervisé et conçu une culture auto-organisée, une analyse de tissus hors cible, un test PCR en anneau et une méthode de conservation par RT, réalisé des expériences, analysé des données, rédigé le manuscrit et approuvé définitivement le manuscrit.

Correspondance à Atsushi Kuwahara.

Ce travail a été financé par AMED sous le numéro de subvention JP21bm0204002 (MT, SK) et par Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Sumitomo). KW, SY, T.Ka., HA, TT, YK, AN, KU, KO, MF, YH, AT, RH, OT, OO, HO, TH, AI, DN, KM, A.Ki. et A .Ku. sont employés par Sumitomo. T.Ki. est membre du conseil d'administration de Sumitomo. SK a un rôle de conseil scientifique pour Sumitomo. MT et MM ont reçu un financement de recherche de Sumitomo. Les auteurs sont co-inventeurs sur les demandes de brevets. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Biju B. Thomas et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrices en chef de la manipulation principale : Simona Chera et Eve Rogers.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Watari, K., Yamasaki, S., Tu, HY. et coll. Auto-organisation, contrôle de la qualité et études précliniques de feuilles rétiniennes dérivées d'iPSC humaines pour la thérapie de transplantation de tissus. Commun Biol 6, 164 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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Reçu : 23 août 2022

Accepté : 31 janvier 2023

Publié: 10 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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