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Sep 15, 2023

Une microperfusion et In

Rapports scientifiques tome 5,

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 18095 (2015) Citer cet article

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Les spectromètres offrent désormais les intensités de champ nécessaires pour visualiser les cellules de mammifères, mais n'ont pas été conçus pour permettre l'imagerie de tissus vivants. En tant que tels, les spectromètres posent des défis importants, dont les plus évidents sont les limitations spatiales, pour mener des expériences sur des tissus vivants. Cette limitation devient problématique lorsque l'on essaie d'utiliser un équipement de perfusion commercial qui est volumineux et - étant conçu presque exclusivement pour la microscopie optique ou les études d'électrophysiologie - inclut rarement la compatibilité MR comme critère de conception. Pour surmonter les problèmes exclusifs aux environnements de champ magnétique ultra-élevé avec un accès spatial limité, nous avons conçu des systèmes de microperfusion et d'oxygénation en alésage capables de s'interfacer avec la série de micro-bobines de surface de Bruker. Ces dispositifs sont conçus pour prendre en charge l'imagerie à résolution cellulaire dans les études RM de tissus vivants excisés. Le système combiné permet un contrôle précis des niveaux de gaz dissous et de pH dans le perfusat, démontrant ainsi l'applicabilité à une large gamme de types de tissus. Sa compacité, son architecture linéaire et son contenu en matériau compatible MR sont des caractéristiques de conception clés destinées à fournir une interface matérielle polyvalente compatible avec n'importe quel spectromètre RMN. De tels attributs assureront l'utilité continue de l'appareil de microperfusion car il peut être utilisé avec une multitude de systèmes RMN contemporains en plus de ceux qui sont actuellement en développement.

Il existe un phénomène clinique bien décrit et établi qui corrèle l'augmentation de l'efficacité du traitement de la maladie avec la diminution de l'intervalle de temps entre le début de la maladie et l'application du traitement1,2,3. Malheureusement, la plupart des diagnostics contemporains reposent sur l'auto-déclaration par le patient de la symptomatologie de la maladie avant que les cliniciens ne rendent le diagnostic et le traitement. Cela permet souvent des périodes très prolongées de développement asymptomatique de la maladie avant que les patients ne reçoivent les traitements nécessaires.

Alors que les tests de biomarqueurs promettent de fournir des outils de dépistage extrêmement sensibles capables de détecter précocement la maladie, raccourcissant ainsi l'intervalle de temps entre l'apparition et le traitement, ces outils offrent généralement peu d'informations sur les caractéristiques spatiales de la pathologie tissulaire au sein de l'organisme vivant. Des informations précises concernant les caractéristiques spatiales des tissus malades ne sont pas triviales dans le cas des soins aux patients, car les cliniciens doivent être en mesure de faire la distinction entre les tissus sains et malsains pour une variété d'applications, y compris la confirmation du diagnostic, la surveillance de la maladie après le traitement et la planification chirurgicale pour l'excision de la tumeur4 . Alternativement, les méthodes de diagnostic qui peuvent offrir des informations spatiales spécifiques aux tissus - telles que le marquage moléculaire après biopsie tissulaire - sont souvent trop limitées dans la portée de leurs données spatiales, ne se prêtent pas à des mesures répétées ou lors de l'examen de certains tissus et entraînent trop souvent des infections secondaires qui compliquer ou empêcher la récupération5. Au cours des dernières années, une résurgence des infections secondaires s'est produite, en particulier dans le cas de la biopsie de la prostate, probablement en raison d'une baisse continue de l'efficacité des antibiotiques postopératoires6,7.

De toute évidence, les méthodes d'imagerie clinique doivent se développer en conjonction avec les améliorations apportées aux méthodes moléculaires de détection des maladies si nous voulons réaliser le plein potentiel de l'une ou l'autre méthodologie pour améliorer la santé des patients. L'identification des caractéristiques RM des tissus sains et malades au niveau cellulaire fournira un aperçu de la façon dont ces états pathologiques à un stade précoce, souvent asymptomatiques, affectent le signal RM et les caractéristiques de contraste. Ainsi, alors que la microstructure tissulaire est actuellement - et peut rester - inaccessible à l'observation directe en clinique, posséder une compréhension approfondie de la façon dont des états pathologiques spécifiques affectent les paramètres de contraste IRM dans le microenvironnement conduira à une compréhension de la façon dont les changements pathologiques se produisant au niveau microscopique se présentent dans les scanners cliniques. Ces données de résolution cellulaire (<10 μm isotrope) doivent être collectées à l'aide d'un équipement d'imagerie à ultra-haut champ car ce sont les seuls systèmes capables de quantifier les paramètres de contraste MR à l'échelle physique pertinente. Par conséquent, il existe un besoin actuel de systèmes d'imagerie RM capables de résoudre l'architecture cellulaire des mammifères pour une utilisation dans des études de caractérisation de tissus sains et malades.

Des études préliminaires d'imagerie par résonance magnétique de la structure cellulaire des mammifères ont été menées exclusivement dans des échantillons de tissus fixes en raison du long temps de collecte nécessaire pour produire des analyses à résolution cellulaire8,9. Alors que ces conditions expérimentales étaient nécessaires pour assurer la stabilité de l'échantillon au cours de longues expériences d'imagerie, ces conditions ne sont pas idéales car le fixateur est connu pour modifier les propriétés osmotiques des tissus, la perméabilité membranaire et les caractéristiques de relaxation10,11,12,13.

Les études de microscopie RM menées sur des explants de tissus vivants ont traditionnellement souffert d'une faible résolution, c'est-à-dire non cellulaire, ainsi que d'un contrôle imprécis des conditions de perfusat au site du tissu isolé. L'incapacité de visualiser directement la structure cellulaire a depuis été surmontée grâce à de vastes améliorations dans la technologie des microbobines à radiofréquence (RF)14,15,16,17,18,19,20,21,22. Cependant, la capacité de contrôler efficacement les conditions de perfusat pendant les expériences de microimagerie MR n'a pas été suffisamment abordée. De nombreuses itérations de dispositifs de perfusion sont disponibles pour les études d'explantation qui offrent un contrôle superbe des conditions d'échantillonnage ainsi que des fonctionnalités innovantes, telles que les réseaux de micro-aiguilles, pour améliorer la livraison de métabolites23,24,25,26. Un inconvénient majeur de la plupart des systèmes de perfusion contemporains est cependant le manque de compatibilité MR au cours des étapes de conception et de conception de leur développement. En conséquence, la modification de ces dispositifs afin qu'ils puissent être interfacés avec les systèmes d'imagerie MR existants est très peu pratique compte tenu des limitations spatiales et matérielles imposées lors de l'utilisation de scanners à champ magnétique ultra-élevé.

Pour répondre au besoin d'un matériel de microperfusion fiable et compatible MR à utiliser avec des explants vivants, nous avons conçu et fabriqué un système de rétention/perfusion tissulaire spécifiquement destiné à être utilisé dans des études de résolution cellulaire. Le système prototype s'interface avec une micro bobine de surface modifiée et disponible dans le commerce (Bruker Biospin, B6370). En plus des schémas détaillés et des procédures de fabrication, nous rapportons les résultats des tests quantifiant la teneur en oxygène dissous et le pH de notre liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) ainsi que la stabilité du signal MR au fil du temps dans des expériences où notre oxygénateur en alésage est utilisé. Dans le cas de la quantification des gaz dissous et du pH, les résultats des tests utilisant l'oxygénateur dans le trou sont comparés à des expériences équivalentes utilisant un dispositif d'oxygénation à membrane externe de conception antérieure27.

Une micro-bobine de surface de 500 μm de diamètre (Bruker Biospin, Z76409) a été modifiée pour s'interfacer avec la plate-forme de micro-perfusion. Un canal (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) a été réalisé à l'arrière de l'assemblage en plastique de la bobine. Deux entretoises en nylon (6 mm LN × 4 mm HT 0,5 mm W) ont été collées le long du canal et limées jusqu'au contour semi-circulaire de la bobine. Deux bosquets bilatéraux plus étroits (3 mm HT × 1,5 mm D) ont été étendus à partir du canal jusqu'à ce qu'ils s'enroulent autour de l'assemblage de la bobine. Un trou (2 mm de diamètre × 14 mm de diamètre) a été percé dans la partie supérieure de l'ensemble de bobine centré sur sa largeur et situé directement derrière la plaque à puce.

Des conduites de perfusion à haute rétention de gaz (Cole-Parmer, 06508-13) ont été utilisées entre le réservoir de perfusat gazé et les oxygénateurs. Dans la configuration de l'oxygénateur externe, cette ligne reliait également l'oxygénateur et le puits de perfusion. Une pompe péristaltique (Masterflex L/S, 7519-20) a conduit la perfusion (2 ml/min). Pour la chambre de perfusion (volume de 150 μm), la tige d'acétal a été usinée en une seule configuration ouverte (9,5 mm OD, 6 mm LN, 6 mm ID). L'extrémité ouverte a été biseautée de 30o pour accueillir un joint en silicone (Amazon, ORS-009-25) qui a été collé à l'aide d'un mastic à la silicone. Un canal horizontal (2,5 mm HT × 1 mm D) a été fraisé dans l'extrémité fermée du puits de perfusion pour accueillir une attache de câble (Thomas & Betts, SF100-18). Les lignes d'entrée et de sortie (Cole-Parmer, S-06418-02) ont été maintenues en place avec de l'uréthane et ont été décalées (3 mm) à l'intérieur du puits pour maximiser l'écoulement turbulent et minimiser les gradients de métabolites. L'anneau de rétention en nylon (5 mm OD, 4 mm ID, 300 μm d'épaisseur) et la maille (4 mm de diamètre, fenêtre de 2 mm × 1,5 mm, taille des pores de 50 μm) ont été façonnés à la main à partir d'une rondelle en nylon (Amazon, B00DHVBPOO) et feuille de nylon tissé (Amazon, CMN-0053-C).

Un tube RMN de 5 mm de diamètre (Wilmad, WG-1000-7) a été modifié en un tube de verre de 16,5 cm de long pour servir de chambre d'entrée de gaz (intérieure). Un trou (1,5 mm de diamètre) a été découpé dans la partie supérieure du capuchon du tube de 5 mm pour recevoir la conduite d'alimentation en carbogène. Ensuite, un tube d'échantillon RMN de 10 mm (Wilmad, 513-1 PP-7FB) a été modifié en un tuyau en verre de 18 cm de long pour former la chambre d'échange de gaz (extérieure). Un trou (6 mm de diamètre) a été découpé au centre du capuchon du tube de 10 mm pour emboîter l'assemblage du tube de 5 mm. Deux trous supplémentaires (diamètre 1 mm) ont été pratiqués dans la partie supérieure du capuchon du tube de 10 mm. L'un servait d'entrée de membrane d'échange tandis que l'autre restait ouvert pour évacuer le carbogène entrant. Un tube d'échange de silicone (HelixMark, 60-011-03) a été introduit à travers le capuchon supérieur du tube de 10 mm, enroulé étroitement autour du tube emboîté de 5 mm à l'intérieur du compartiment d'échange de gaz et passé à travers un second capuchon de tube RMN de 10 mm situé au niveau de l'oxygénateur. base. Ce capuchon abritait une cheville en acétal (20 mm HT, 2 mm Dia.) en son centre maintenue en place par de l'uréthane. Les longueurs externalisées des tubes d'échange de gaz ont été réduites à deux segments de 10,0 mm reliés par un coupleur en nylon de 1/16" (Eldon James Corp., C0-1 NN) aux lignes de perfusion (Cole-Parmer, S-06418-02) offrant un rétention de gaz La ligne de perfusion sortant du fond de l'oxygénateur a été couplée directement à la ligne d'entrée de la chambre de perfusion Le capuchon inférieur du tube RMN de 10 mm a été fixé sans uréthane comme moyen d'accéder à l'intérieur du dispositif oxygénateur pour le remplacement de la membrane.

Les mesures du pourcentage d'oxygène dissous du perfusat d'aCSF (NaCl 120 mM, NaHCO3 26 mM, KH2PO4 1,5 mM, MgSO4·7 H2O 1,4 mM, CaCl2·2 H2O 2 mM, KCl 3 mM, Glucose 10 mM ; osmolalité = 300 mOsm) ont été recueillies à l'aide d'un compteur d'oxygène (Microelectrodes Inc., OM-4) interfacé à une sonde à microélectrode à volume limité (Microelectrodes Inc., MI-730). Plusieurs essais (n = 6) ont été menés dans lesquels des mesures d'oxygène dissous ont été prises à partir du réservoir de perfusat qui a été directement barboté avec 95 % d'O2, 5 % de carbogène de CO2 (contrôle positif) ou à partir de la chambre de perfusion lors d'essais dans lesquels l'in-bore l'oxygénateur était alimenté en gaz à teneur variable en oxygène (air ambiant, 95 %, 60 % et 19 %). Afin de comparer la fonction de l'oxygénateur dans l'alésage à l'oxygénateur à membrane externe, des mesures supplémentaires (n = 10) ont été faites dans la chambre de perfusion tout en utilisant le dispositif d'oxygénateur externe alimenté en gaz carbogène (95 % O2, 5 % CO2) pendant l'installation fonctionnement (2 ml/min).

Les lectures de pH du perfusat aCSF ont été évaluées à l'aide d'un pH-mètre Accumet Basic (Fisher Scientific, AB15) interfacé à une sonde d'échantillon à faible volume (Mettler Toledo, 6030-02-BNC). Les mesures ont été prises dans le puits de perfusat (n = 8) avec la plate-forme de perfusion opérationnelle (2 ml/min) interfacée avec l'oxygénateur à membrane externe ou interne. Le réservoir aCSF a été directement barboté avec du gaz carbogène (95 % O2, 5 % CO2) tandis que le même mélange gazeux était fourni aux oxygénateurs externes et internes. Les résultats des huit essais ont été moyennés et les moyennes des deux groupes de traitement comparées à la plage de pH physiologique cible (7,3 à 7,4).

Toutes les images ont été réalisées sur un spectromètre 600 MHz (Oxford) équipé de gradients de micro-imagerie (Bruker Biospin ; Micro 5). La température de l'échantillon (23 ° C ± <1 ° C) a été mesurée en continu et maintenue constante à l'aide d'une boucle de rétroaction du thermocouple à une unité de refroidissement (Bruker, BCU II -80/60) qui contrôle la température de l'air traversant l'alésage du spectromètre. Toutes les données ont été recueillies à l'aide d'une séquence d'écho de spin pondérée en diffusion. La pondération de diffusion a été maintenue constante à b = 1200 s/mm2 : un compromis offrant une sensibilité suffisante aux modifications tissulaires ainsi qu'un rapport signal/bruit adéquat (400 à 500 SNR typique) dans le temps de balayage disponible. L'analyse des données a été effectuée hors ligne à l'aide d'une boîte à outils statistique (Microsoft Excel) et de Matlab®. Quatorze balayages d'écho de spin consécutifs pondérés en diffusion (TR/TE = 2000/11,64 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrope, durée = 1,5 h, Avg = 42) ont été collectés (n = 3) comparant le signal stabilité dans le temps (21 h au total). Un calage manuel a été utilisé pour garantir des conditions de terrain homogènes28. Les paramètres de calage ont été évalués à l'aide de mesures de largeur de ligne à ½ hauteur du pic du signal d'eau - généralement ≤ 35 Hz - qui ont été observées à la fois en présence et en l'absence de l'oxygénateur intégré : c'est-à-dire que l'utilisation de l'appareil n'a pas induit d'inhomogénéités de champ détectables. Des protocoles d'imagerie identiques ont été employés dans chacun des deux groupes expérimentaux : une série avec perfusion continue (2 ml/min) et une série sans perfusion (témoin stable). Les lectures brutes du signal de diffusion - obtenues sous forme d'intensité moyenne du signal dans une région d'intérêt - à partir des trois images prises à chacun des quatorze points temporels ont été moyennées et tracées en fonction du temps pour évaluer la variabilité du signal intra-groupe au cours de l'expérience de 21 h. Des comparaisons statistiques entre les groupes de traitement ont été effectuées à l'aide de tests d'équivalence. La plage d'équivalence (+/-9 % moyenne) a été déterminée sur la base du changement de signal total au sein du groupe observé dans le groupe témoin statique non perfusé - c'est-à-dire stable - au cours de l'étude. Les deux ensembles de données d'imagerie pour nos tests de stabilité ont été effectués sur un cortex de souris fixe (300 μm d'épaisseur) afin d'éliminer les modifications morphologiques de l'échantillon comme cause possible de toute modification du signal de diffusion observée.

Des tranches corticales aiguës (n = 4, 300 μm d'épaisseur) de rats ont été isolées via un vibratome dans un bain gazé en continu (95% O2, 5% CO2), 4 ° C aCSF avant d'être introduites dans la plate-forme de microperfusion. Les échantillons ont été acclimatés à 23 ° C sous perfusion continue pendant une période de 1 h avant l'imagerie. Des images pondérées en diffusion (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrope) ont été recueillies à des intervalles d'imagerie longs et courts (durée = 1,5 h, Avg = 42 ; durée = 4 min, Avg = 2) avec des variations dans les conditions de perfusion (continus = balayages de 1,5 h avec perfusion pendant toute la durée de 21,5 h ; intermittents = balayages de 1,5 h avec perfusion désactivée pendant la collecte des données mais activées pendant des intervalles de perfusion de 10 min ; intervalle long/balayage long = Scans de 1,5 h avec perfusion activée pendant la collecte de données et désactivée pendant les intervalles de 10 minutes entre les scans ; scans à intervalle long/court = scans de 4 min pris avec perfusion désactivée entrecoupés d'intervalles de 1,5 h avec perfusion activée). Les données du cortex non perfusé ont été générées avec une tranche aiguë en direct placée dans la plate-forme et imagée (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrope, durée = 1,5 h, Avg = 42) sur une durée de 15,5 h en l'absence d'échange de perfusat aCSF. De même, des données de contrôle stables ont été générées à l'aide d'une tranche fixe sur une durée de 18,5 h avec des paramètres d'imagerie identiques en l'absence de perfusion. L'intensité du signal de diffusion (unités arbitraires) a été enregistrée sur une durée de 15,5 h à 21,5 h selon le groupe expérimental.

Des schémas détaillés de la modification de la bobine de surface micro, de l'assemblage de la plate-forme de microperfusion et du dispositif d'oxygénation dans l'alésage sont fournis (figures 1 et 2). Un schéma fonctionnel de l'assemblage de la plate-forme avec les pièces jointes de l'oxygénateur externe et interne est également illustré (Fig. 3).

Schéma éclaté détaillant les composants individuels de la plate-forme de microperfusion.

(a) Perfusat bien usiné à partir d'une tige d'acétal (volume de 150 ul, 9,5 mm OD, 6 mm LN, 6 mm ID). Le côté ouvert (······) est biseauté de 30° par rapport à la verticale pour permettre l'installation d'un joint en silicone. Le côté fermé contient un canal horizontal (2,5 mm HT × 1 mm D) dans lequel un serre-câble à profil bas (Thomas & Betts, SF100-18) (non illustré) sert de moyen non permanent de sceller la chambre de perfusion. Les lignes d'entrée et de sortie (Cole-Parmer, S-06418-02) pénètrent par le haut du puits de perfusion et sont fixées en place avec de l'uréthane à haute résistance au pelage appliqué à l'extérieur. (b) Joint torique en silicone (Amazon, ORS-009-25) qui sert de joint étanche aux liquides entre le puits de perfusion et le puits de tissu. Il est fixé au puits de perfusion à l'aide d'un mastic silicone sans danger pour les aquariums. (c) Anneau de rétention en nylon (5 mm OD, 4 mm ID, paroi 0,5 mm, 300 μm d'épaisseur) façonné à la main à partir d'une rondelle plate en nylon (Amazon, B00DHVBPOO). Le diamètre interne a été élargi à 3,97 mm à l'aide d'un poinçon à tôle. L'épaisseur a été réduite à l'aide d'une lime métallique. Enfin, une encoche (2 mm) a été découpée dans l'anneau avec un scalpel pour permettre la compression avant l'insertion dans le puits de tissu. ( d ) Du nylon tissé (Amazon, CMN-0053-C) d'une taille de pores de 50 μm a été utilisé dans la construction du treillis de rétention. Un disque circulaire (4 mm de diamètre) a été découpé dans la feuille et une fenêtre (2 mm x 1,5 mm) a été découpée dans la partie centrale chevauchant la face de la bobine. Cette fenêtre a facilité le placement des tissus en permettant une visualisation claire de la région de l'échantillon en contact avec la bobine et a empêché le nylon d'entrer dans le profil d'excitation de la bobine. (e) Des tranches de tissu (hippocampe illustré) de 300 μm d'épaisseur sont placées en contact direct avec la bobine de surface et suspendues verticalement à l'aide de l'insert en maille et de l'anneau de rétention. (f) La micro-bobine de surface à quatre tours (diamètre de 500 μm) est représentée au bas du diamètre de 5 mm. tissu bien. Les composants supplémentaires de l'ensemble de bobine (conducteurs, condensateurs, base en plastique, etc.) ne sont pas représentés.

Photographies de la microbobine modifiée de 500 μm et schéma détaillé de l'oxygénateur en alésage.

(a) Vue arrière de l'assemblage de la microbobine illustrant un canal fraisé (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) flanqué d'entretoises en nylon (, 6 mm LN × 4 mm HT × 0,5 mm W) qui attrapent un faible serre-câble profilé (Thomas & Betts, SF100-18). (b) Vue de face de la microbobine détaillant les bosquets bilatéraux (, 3 mm HT × 1,5 mm D). Les découpes ont fourni un dégagement pour le serre-câble utilisé pour sceller de manière réversible le puits de perfusion. (c) Vue de dessus de l'assemblage de la bobine. Un trou (2 mm de diamètre × 14 mm de diamètre) accueille la cheville de support en acétal de l'oxygénateur dans l'alésage. ( d ) Schéma détaillé du dispositif d'oxygénation dans l'alésage (tubes RMN emboîtés et ouverts de 5 mm et 10 mm; 19 cm de haut x 1 cm de large). Après avoir traversé un piège à bulles en ligne, le perfusat d'aCSF pénètre dans l'oxygénateur à travers un tube en silicone hautement perméable aux gaz (HelixMark, 60-011-03). Cette tubulure () qui constitue la membrane d'échange gazeux du dispositif oxygénateur a été enroulée étroitement à l'intérieur des tubes RMN emboîtés afin de maximiser la surface sur laquelle se produit l'échange gazeux. Le gaz carbogène entre par un orifice situé en haut du capuchon du tube de 5 mm et passe dans la chambre d'échange de gaz (tube RMN de 10 mm) par le fond ouvert du tube de 5 mm (). Le placement d'un évent au sommet du tube de 10 mm garantit que le carbogène passe sur la membrane enroulée lorsque le gaz sort de l'ensemble oxygénateur. L'aCSF saturé en carbogène sort par le capuchon inférieur du tube de 10 mm et pénètre dans la chambre de perfusion. La distance considérablement réduite entre le site d'échange de gaz et le site de perfusion tissulaire (2 cm dans l'alésage contre 500 cm à l'extérieur) explique les propriétés de rétention de gaz grandement améliorées observées. Le LCR artificiel sort de la plate-forme par une ligne de retour sur son chemin vers un réservoir de déchets situé à l'extérieur du spectromètre. Les extrémités de la membrane en silicone () ont été épissées aux lignes Tygon® () (Cole-Parmer, S-06418-02) à l'aide de coupleurs en nylon () (Eldon James, C0-1AGHDPE).

Schémas fonctionnels de la plate-forme de microperfusion dans des configurations à double oxygénateur.

(a) Configuration de l'oxygénateur externe. Des lignes de microperfusion excessivement longues (5 m) (Cole-Parmer, 06508-13) entre l'oxygénateur externe (45 cm de large × 60 cm de haut × 30 cm de profondeur) et la chambre de perfusion entraînent un dégazage important de notre perfusat aCSF avant de rencontrer le tissu tranche. Ce dégazage était responsable des conditions de faible teneur en oxygène (perte d'O2) et de pH élevé (perte de CO2) enregistrées dans la chambre de perfusion avec la configuration de l'oxygénateur externe et a été rencontrée malgré notre utilisation de lignes de perfusion conçues pour une rétention de gaz élevée. (b) Configuration de l'oxygénateur dans le trou. L'oxygénateur à membrane (19 cm de hauteur × 1 cm de diamètre) et le piège à bulles (9 cm de hauteur × 1 cm de diamètre) de la plate-forme de microperfusion ont été repensés en utilisant exclusivement des matériaux compatibles MR. De plus, les dimensions de ces composants ont été réduites de sorte qu'ils peuvent maintenant s'adapter directement à l'intérieur du canal étroit de l'alésage du spectromètre (3,5 cm de diamètre). Alors qu'un dégazage important se produit toujours entre le réservoir d'aCSF à bulles de carbogène et le spectromètre d'imagerie, le dispositif d'oxygénation en alésage réduit considérablement la longueur de la ligne de perfusion entre le point terminal de l'échange de gaz et l'échantillon de tissu (2,5 cm), préservant ainsi l'oxygène dissous physiologiquement pertinent et Valeurs de pH.

La teneur en oxygène dissous mesurée dans l'aCSF au niveau du tissu (n = 6) en fonction des gaz à teneur en oxygène variable fournie par le dispositif d'oxygénation en alésage est indiquée (Fig. 4). Le gaz atmosphérique (20–22 % O2) et trois mélanges de carbogène (5 % CO2) avec différentes concentrations d'oxygène (95 %, 60 %, 19 % O2) ont été testés dans l'oxygénateur interne. Les lectures moyennes d'oxygène dissous pour les résultats de six essais étaient de 23,0 %, 96,2 %, 59,1 % et 19,2 % pour l'air ambiant (20-22 %), 95 %, 60 % et 19 % de gaz O2 respectivement. Les résultats sont comparés à des essais témoins positifs (n = 6) menés dans le réservoir de perfusat pendant le barbotage direct de gaz carbogène 95 % O2, 5 % CO2 : 95,1 % O2 mesuré. Des mesures répétées indiquent un effet de saturation de gaz à 100 % (c'est-à-dire que le pourcentage de saturation au niveau du tissu correspond au pourcentage de teneur en O2 du gaz fourni) lors de l'utilisation de l'oxygénateur interne. Inversement, lors de l'utilisation de l'oxygénateur externe, la teneur en gaz dissous au niveau du site de perfusion tissulaire n'était pas équivalente au pourcentage de teneur en oxygène du gaz d'alimentation (tableau 1). Lors d'essais répétés (n = 10), la teneur moyenne en oxygène dissous dans l'aCSF au niveau du site de perfusion tissulaire était de 43,43 % d'O2 lors de l'utilisation d'un gaz d'alimentation à une concentration de 95 % d'O2. Cela représente une perte de 54,3 % d'O2 dissous total survenant entre le réservoir de perfusat (témoin positif à 95,54 % d'O2) et la chambre de perfusion (43,43 % d'O2), telle que mesurée à l'aide de l'oxygénateur à membrane externe.

Propriétés de l'oxygène gazeux dissous (O2) de l'aCSF au site de perfusion tissulaire à l'aide de l'oxygénateur en alésage avec des gaz à teneur variable en oxygène.

Trois mélanges de gaz carbogène (5 % CO2 + 95 %, 60 %, 19 % O2 balance N2) sont comparés à un réservoir d'aCSF exposé au gaz atmosphérique (20-22 % O2 ; 23 % mesuré) et à un contrôle positif (directement barboté 95 % O2, 5% CO2 carbogène). Dans les trois cas, la teneur en oxygène dissous mesurée dans le aCSF approche la saturation à 100 % de la concentration contenue dans le mélange gazeux fourni. Les données sont présentées sous forme de moyennes de groupe (n = 6) avec des barres d'erreur positives égales à l'écart type calculé.

Les résultats de plusieurs essais (n = 8, gaz d'alimentation = 95 % O2, 5 % CO2) mesurant le pH au site de perfusion tissulaire sont présentés (tableau 1). La lecture moyenne du pH dans l'aCSF à l'aide du dispositif d'oxygénation interne (7.32) a été comparée à celle prise à l'aide de l'oxygénateur externe (8.13). Seules les lectures prises lors de l'utilisation de l'oxygénateur interne se situaient dans une plage de pH cible choisie pour sa capacité à maintenir le métabolisme du tissu neural physiologiquement pertinent (7,3–7,4). Les résultats des mesures de pH d'un réservoir de aCSF directement barboté (contrôle positif, 7,36) se situaient dans la plage physiologique tandis que celles prises à partir d'un réservoir de aCSF non traité (c'est-à-dire dégazé) (contrôle négatif, 8,22) étaient plus similaires aux lectures observées lors de l'utilisation de l'oxygénateur externe .

Le signal RM pondéré en diffusion (unités arbitraires) en fonction de la durée de l'expérience (21 h au total) est rapporté pour deux conditions expérimentales : essais avec perfusion continue (2 ml/min) et essais statiques sans perfusion (contrôle) (Fig. 5 ). Le signal moyen de plusieurs expériences (n = 3) est calculé et représenté graphiquement à 12 points de temps distincts de 1,5 h. Les tests statistiques d'équivalence ont déterminé que les critères d'équivalence étaient remplis à tous les moments testés. Les données présentées aux points temporels de 4,5 et 6,0 h (n = 2) contenaient une mesure de moins que les groupes restants en raison d'un dysfonctionnement matériel survenu lors de la collecte de la troisième série (Figs S1 et S2) et ont donc été exclues des tests statistiques. .

Test de stabilité du signal MR dans des tranches corticales de souris fixes (300 μm) dans des conditions de perfusion constante et sans perfusion.

Signal pondéré en diffusion (unités arbitraires) dans le temps (21 h au total) dans des séries d'imagerie avec contrôle continu (: 2 ml/min) et statique (: pas de débit de perfusat). Le signal moyen (n = 3) sur 12 expériences d'imagerie distinctes est rapporté. L'une des trois mesures aux points temporels de 4,5 et 6,5 h a été exclue de la troisième série en raison d'un dysfonctionnement du matériel qui a affecté la collecte. Les tests statistiques montrent que les conditions d'équivalence entre les groupes (plage = variance du signal dans le temps [21 h] présentées par notre groupe de contrôle statique [± 9 %]) ont été remplies aux 12 points temporels testés. Les données sont présentées sous forme de moyennes de groupe avec des barres d'erreur positives et négatives égales à l'écart type. Les barres d'erreur ont été omises du groupe de contrôle statique pour plus de clarté.

La stabilité des tissus, telle qu'indiquée par l'intensité du signal MR pondérée en diffusion, a été analysée pour tous les ensembles de données de tranches vivantes en fonction de la durée de l'expérience (15, 5 à 21, 5 h) (Fig. 6). Le signal signalé à chaque instant est l'intensité moyenne du signal sur une grande région d'intérêt (ROI). Pour chaque échantillon, le même retour sur investissement a été utilisé pour tous les points dans le temps. Pour permettre la comparaison de la stabilité du signal entre les stratégies de perfusion, nous normalisons chaque série de données à l'intensité lors de sa mesure initiale (3 h). Dans cette présentation de données, un tissu insuffisamment perfusé afficherait une intensité de signal accrue au fil du temps en raison d'une diffusivité réduite causée par l'ischémie. Nous incluons également la courbe de signal du tissu fixe (également normalisée à son intensité au point de temps initial) comme série chronologique de référence d'un échantillon complètement stable. Des expériences utilisant quatre protocoles de perfusion indépendants sont comparées à du tissu fixe (témoin stable) et à du tissu vivant non perfusé (témoin de métabolite insuffisant). Comme prévu, le cortex non perfusé (, Fig. 6a) affiche une augmentation abrupte et soutenue du comportement du signal de diffusion. Inversement, les mesures de diffusion obtenues à partir de l'échantillon fixe restent relativement constantes tout au long de la durée de 18,5 h (). Les tranches corticales vivantes perfusées (Fig. 6a) présentent divers degrés de changement de signal de diffusion, le plus important étant observé dans l'échantillon de cortex perfusé en continu () après le point de temps de 14 h. Sur la figure 6a, les régimes de perfusion restants sont les suivants : perfusion intermittente (), intervalles de perfusion longs suivis de balayages courts () et intervalles de perfusion longs suivis de balayages longs (). Veuillez vous référer à la section méthode sur Live Slice Perfusion pour les longueurs d'intervalle.

Caractérisation de tranches corticales vivantes et aiguës de rats à l'aide de l'appareil de microperfusion et d'oxygénation dans le trou.

Le signal MR pondéré en diffusion (unités arbitraires) normalisé à la mesure initiale (3 h) en fonction de la durée de l'expérience (15,5 à 21,5 h) est rapporté. (a) Des expériences utilisant quatre protocoles de perfusion indépendants sont comparées à des tissus fixes (contrôle stable) et à des tissus vivants non perfusés (insuffisance métabolique). Le cortex non perfusé présente une augmentation brutale et soutenue du signal de diffusion (3 à 15,5 h) tandis que l'échantillon fixe reste relativement constant tout au long (3 à 18,5 h). Les tranches corticales aiguës subissant une perfusion présentent de modestes changements de signal au fil du temps qui sont intermédiaires à ceux observés dans les deux conditions de contrôle. Clé d'essais perfusés (continu = balayages de 1,5 h avec perfusion pendant 21,5 h ; intermittents = balayages de 1,5 h avec perfusion désactivée pendant la collecte de données mais activées pendant des intervalles de perfusion de 10 min ; intervalle long/balayage long = balayages de 1,5 h avec perfusion allumé pendant la collecte de données et éteint pendant les intervalles de 10 minutes entre les balayages ; balayages à intervalle long/court = balayages de 4 min effectués avec perfusion désactivée entrecoupés d'intervalles de 1,5 h avec perfusion activée). (b) Lors du regroupement des données d'essais perfusés sur leur cours de temps partagé (3 à 15,5 h), ces tranches présentent un comportement de stabilité du signal de diffusion similaire aux témoins de tissus fixes. Le signal MR pondéré en diffusion (unités arbitraires) normalisé à la mesure initiale (3 h) est rapporté en fonction du temps. Les données sont rapportées sous forme de moyennes de groupe (n = 4) avec des barres d'erreur positives et négatives égales à l'erreur type de la moyenne.

La figure 6b montre toutes ces stratégies de perfusion regroupées et comparées à l'évolution temporelle du signal d'une tranche aiguë non perfusée et d'un échantillon fixe. Ce graphique est limité à l'évolution temporelle inclusive de toutes les conditions mesurées (3,0 h à 15,5 h; Fig. 5b). Les tranches corticales perfusées présentent des caractéristiques de signal de diffusion stables apparentées aux contrôles de tissus fixes.

Dans la présente étude, nous décrivons un système de microperfusion et un dispositif d'oxygénation nouvellement conçus et fabriqués pour une utilisation dans des études d'explantation menées dans des environnements de champ magnétique ultra-élevé. Ces composants ont été conçus spécifiquement pour se conformer aux limitations spatiales et matérielles intenses imposées par les équipements d'imagerie MR à champ élevé utilisés dans les études cellulaires et possèdent donc des caractéristiques particulières non disponibles dans les équipements de microperfusion commerciaux existants. Il est important de noter que les matériaux de la plate-forme sont tous compatibles avec l'environnement électromagnétique (champs statiques et variables dans le temps) de l'expérience MR afin qu'ils soient à la fois sûrs à manipuler et n'interfèrent pas avec la qualité de la mesure (par exemple en détériorant l'homogénéité du champ principal). De plus, notre dispositif d'oxygénation interne présentait des caractéristiques de saturation en oxygène dissous (O2) à 100 % testées à l'aide de plusieurs concentrations d'oxygène dans un gaz d'alimentation en carbogène prémélangé (Fig. 4). Ces résultats indiquent une perte d'O2 virtuelle de 0 % dans la saturation en oxygène gazeux de notre aCSF lors de l'utilisation de l'oxygénateur en alésage et de la plate-forme de microperfusion. De plus, ils démontrent que la saturation en O2 au site de perfusion tissulaire peut être contrôlée avec précision en régulant sa concentration dans le mélange de gaz d'alimentation. Cette fonctionnalité augmente le contrôle de l'opérateur en permettant aux chercheurs d'adapter les conditions expérimentales en fonction des différences spécifiques aux tissus - et même dépendantes de l'activité - dans les exigences métaboliques29,30,31,32. Une telle précision et un tel contrôle à l'emplacement de la perfusion tissulaire - dans ce cas, à l'intérieur de l'alésage d'un spectromètre d'imagerie - sont indispensables pour créer des études scientifiques bien construites et reproductibles avec des préparations d'échantillons ex vivo. Notre découverte selon laquelle plus de la moitié (54,3 %) de la teneur en O2 dissous de notre aCSF a été perdue pendant le trajet d'un oxygénateur à membrane externe au puits de tissu (5 m) met en évidence la nécessité d'un développement matériel supplémentaire spécifique à la MR. Le fait que de tels résultats aient été obtenus même en utilisant des lignes de perfusion à haute rétention et à faible perméabilité aux gaz (Cole-Parmer, 06508-13) suggère que des solutions d'ingénierie simples adaptées à un équipement de perfusion préexistant ne seront pas suffisantes pour obtenir des conditions expérimentales appropriées en microscopie IRM ex vivo. études.

Bien que l'étude actuelle n'inclue pas la quantification directe du gaz CO2 dissous comme cela a été effectué avec de l'oxygène, les lectures de pH dans notre aCSF tamponné au bicarbonate ont servi de mesure sensible des effets du gaz. Cela est dû au rôle que joue le CO2 fourni dans la formation d'ions carbonate et bicarbonate - et donc de protons libres - via un intermédiaire d'acide carbonique dans le cadre du système tampon de bicarbonate :

Les constituants chimiques décrits sont les mêmes utilisés naturellement dans le but de réguler le pH physiologique chez les mammifères via des processus métaboliques respiratoires et excréteurs33,34. Lorsqu'il est fourni à un perfusat ou à un milieu de culture contenant un tampon de bicarbonate, le CO2 agit pour stabiliser le pH dans une plage physiologiquement acceptable pour les tissus nerveux des mammifères : 7,3 à 7,435,36. C'est pourquoi le CO2 est utilisé de manière omniprésente dans les mélanges de gaz carbogène (95 % O2, 5 % CO2) fournis aux systèmes de culture de tissus tamponnés au bicarbonate. L'ajout de CO2 dans un tel système entraîne une augmentation de l'acide carbonique et donc une augmentation des ions bicarbonate et hydrogène dans lesquels ce composé se dissocie, entraînant finalement une baisse du pH. Inversement, si les conditions dans le milieu deviennent trop acides, les ions hydrogène en excès seront piégés par le bicarbonate et seront incorporés dans les molécules d'eau lors de la libération de CO2, ce qui entraînera une augmentation du pH. Le maintien de conditions de pH physiologiquement pertinentes dans un milieu tamponné au bicarbonate dépend donc d'un apport constant de gaz CO2. La concentration de CO2 présente dans les mélanges de carbogènes utilisés dans la présente étude (5 %) est une norme industrielle connue pour être suffisante pour maintenir ces conditions ; cependant, lorsqu'il était utilisé comme gaz d'alimentation en conjonction avec l'oxygénateur à membrane externe, le pH mesuré au site de perfusion tissulaire était de 8,13 : excessivement alcalin par rapport à notre plage de pH cible de 7,3 à 7,4. Ces données ont été observées malgré le maintien des conditions de pH cibles dans le réservoir aCSF utilisé pour alimenter la plate-forme en perfusat (tableau 1). Nos mesures de pH prises à l'aide de l'oxygénateur externe couplées à notre connaissance de la chimie du tampon bicarbonate décrite ci-dessus ont suggéré qu'un apport insuffisant d'ions bicarbonate - et donc de protons libres - était maintenu dans notre aCSF au site de perfusion tissulaire. Étant donné que ce problème n'était pas présent dans notre aCSF en amont du puits de tissu, nous avons pu conclure que le changement involontaire de pH s'est développé lorsque notre perfusat a traversé la longueur de la plate-forme de perfusion : en particulier les 5 m de lignes de perfusion reliant l'oxygénateur à membrane externe à notre chambre de perfusion tissulaire. La cause la plus probable du décalage observé a donc été déterminée comme étant une diminution de pCO2 survenant sur la distance prolongée des lignes de perfusion nécessaires pour atteindre le centre du spectromètre d'imagerie. Les résultats de nos tests O2 utilisant l'oxygénateur externe décrit ci-dessus (tableau 1) ont confirmé plus tard qu'une quantité excessive de gaz dissous s'échappait à travers nos lignes de perfusion par des processus diffusifs.

Alors qu'une variété de tampons sont disponibles, notamment les tampons de Good utilisés dans la majorité des recherches biologiques37, il a été démontré que les systèmes de perfusat tamponnés sans bicarbonate modifient le potentiel de membrane au repos des neurones de l'hippocampe38. Ainsi, alors que des conditions de pH physiologiquement pertinentes auraient pu être obtenues plus facilement en remplaçant le bicarbonate de sodium par un agent tampon alternatif, certaines considérations, y compris un œil vers de futures études fonctionnelles, nous ont empêchés d'employer une telle solution. De plus, bien que le changement de tampons nous ait permis d'atteindre un pH physiologiquement pertinent lors de l'utilisation de l'oxygénateur externe, les problèmes de perte d'oxygène gazeux dissous seraient restés.

Lors de l'intégration de l'oxygénateur à membrane en alésage dans notre plate-forme de microperfusion, les lectures de pH dans le puits de tissu ont été régulées dans la plage de pH cible (tableau 1). La distance entre le site final de gazage du perfusat et l'échantillon de tissu a été réduite d'un facteur 250 (5 m contre 2 cm) après l'échange des dispositifs d'oxygénation (Fig. 3). Une telle réduction de la longueur des lignes de perfusion entre les sites d'échange gazeux et de perfusion tissulaire a empêché la perte de CO2 dissous en diminuant à la fois la surface globale et le temps pendant lesquels ces pertes par diffusion pourraient se produire.

La grande majorité des études de microscopie MR ex vivo à ce jour ont utilisé la perfusion discontinue dans le cadre de leur protocole d'imagerie afin d'éliminer les artefacts de flux résultant du déplacement du perfusat39,40,41,42,43,44,45,46. Alors que les expériences de contrôle dans ces études ont rapporté la stabilité du signal MR en utilisant des méthodes de perfusion intermittente, des études métaboliques ont montré que les explants tissulaires bénéficient physiologiquement du renouvellement continu du perfusat47,48. De tels résultats ne sont pas surprenants étant donné le rôle du perfusat à la fois dans la fourniture de nutriments vitaux et dans l'élimination des sous-produits toxiques du métabolisme. Dans l'étude actuelle, en raison de la faible profondeur de pénétration de la micro surface-coil et de sa séparation spatiale du perfusat en raison de la partition tissulaire (300 μm, Fig. 1), nous avons émis l'hypothèse que la perfusion pourrait être maintenue pendant l'acquisition d'images sans générer d'artefacts de flux . Pour tester cela, nous avons comparé les acquisitions de diffusion du cortex de souris fixe au fil du temps (21 h) dans des conditions de perfusion continue et de perfusat statique et immobile (Fig. 5). Dans des analyses similaires pondérées en diffusion de tranches d'hippocampe perfusées et aiguës réalisées au sein de notre groupe de recherche, la stabilité du signal a été démontrée sur un intervalle de temps de 8 h en utilisant un protocole de perfusion intermittente qui a fourni une perfusion de 5 min à un débit de 2 ml/min pour chaque 1,5 h du temps de balayage49. Les auteurs ont signalé une variation d'environ 8 % du signal de diffusion brut sur l'intervalle de 8 h pour leur groupe de tissus stables et perfusés. Cette valeur est assez proche de la variabilité du signal de diffusion brute de 9 % rapportée dans l'étude actuelle pour notre groupe de contrôle statique (Fig. 5). Compte tenu des différences entre les deux études, en particulier l'utilisation de tranches aiguës plutôt que fixes, la variation de signal de diffusion étonnamment similaire observée est plus probablement le résultat de limitations de stabilité inhérentes au matériel d'imagerie utilisé plutôt que de changements se produisant dans l'échantillon de tissu.

Dans le cas de notre expérience de tissus vivants réalisée sur des tranches corticales aiguës, la stabilité du signal de diffusion a été maintenue pendant une période de 15,5 h après l'heure de la mort (TOD) et la préparation ultérieure de l'échantillon avant l'imagerie (Fig. 6). L'épaisseur de la tranche (300 μm) et la température de fonctionnement de 23 o C ont été sélectionnées pour obtenir une tension d'oxygène suffisante dans l'ensemble de l'échantillon, tandis que les conditions de perfusat (95 % d'O2 dissous, débit de 2 ml/min) ont assuré une administration efficace des métabolites et l'élimination des déchets50,51. Inversement, l'augmentation précoce de l'intensité du signal de diffusion observée dans la tranche vivante non perfusée était concomitante à un œdème cellulaire provoqué par une défaillance liée à l'épuisement de l'ATP des pompes ioniques dans les membranes plasmiques des cellules de la tranche. Le gonflement des tissus induit par l'hypoxie est le mécanisme physique responsable de la diminution de la diffusivité dans la tranche qui se manifeste par une augmentation du signal IRM pondéré en diffusion. Les échantillons perfusés à l'aide de l'oxygénateur intégré présentaient une stabilité du signal de diffusion bien supérieure à celle du témoin compromis par le métabolite, car leur changement de signal de diffusion au fil du temps était similaire à celui observé dans l'échantillon de tissu fixe. Comme on pouvait s'y attendre, la variabilité entre les groupes a augmenté en fonction du temps dans les données moyennes de nos quatre échantillons perfusés, ce qui peut être apprécié par l'amplitude croissante de l'erreur mesurée au fil du temps (Fig. 6b). Fait intéressant cependant, l'échantillon perfusé en continu présentait de loin le plus grand changement de signal de diffusion au fil du temps des quatre tranches perfusées malgré l'hypothèse selon laquelle ce tissu était exposé aux conditions métaboliques les plus favorables (Fig. 6a). Il convient de noter que ces changements se sont produits après le point de temps de 14 h : plus tard que le cours temporel de 6 à 12 h pendant lequel les tranches aiguës sont viables pour les enregistrements électrophysiologiques et bien plus tard que la limite de 4 h après laquelle des neurones argyrophiles compromis ont été observés dans des conditions similaires. entretien physiologique54. De tels effets sur la santé des tranches ont été liés à l'exposition aux lipopolysaccharides et aux lipopeptides présents dans les parois cellulaires des bactéries55. Ces bactéries sont présentes dans les milieux de perfusion et subissent des augmentations logarithmiques de densité de population qui débutent entre la 6ème et la 12ème h d'incubation. Heureusement, des solutions d'ingénierie ont déjà été développées qui prolongent le taux de prolifération des bactéries dans le perfusat d'aCSF et par la suite la période de temps pendant laquelle les préparations de tranches aiguës restent fonctionnellement viables. En utilisant la suppression de la température et la filtration de la lumière ultraviolette (UV), des chercheurs de l'Université de Western Sydney ont fabriqué un système de perfusion spécialisé capable de préserver les caractéristiques électrophysiologiques des tranches aiguës pendant des périodes de 24 à 36 h56. Le succès démontré de ces techniques a d'immenses implications pour la collecte d'images de microscopie RM qui prennent généralement des heures à compléter. L'incorporation d'un dispositif de filtre UV en amont de l'oxygénateur en alésage dans la configuration actuelle - peut-être intégrée dans le mécanisme du piège à bulles - a le potentiel de doubler ou de tripler la période de viabilité dans les études d'explantation tissulaire.

Nous espérons que la conception actuelle de la plate-forme décrite et testée ici sera utilisée dans les études de résolution cellulaire par IRM d'explants de tissus vivants ainsi que pour aider au développement futur de dispositifs de perfusion compatibles MR.

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Nous remercions nos collègues collaborateurs de l'UF : S Roper, G Walter, M King, J Lin, L Su, B Vemuri, M Grant, G Peter. Externe : G Stanisz (Université de Toronto), L Guay-Woodford (Université de Birmingham, Alabama). Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) et de la National Science Foundation (accord de coopération n° DMR-1157490) par le biais du National High Magnetic Field Laboratory (NHMFL) Advanced Magnetic Resonance Imaging and Installation de spectroscopie (AMRIS) à l'UF et dans l'État de Floride.

Département de neurosciences, Université de Floride, Gainesville, Floride, États-Unis d'Amérique

Jeremy J. Flint et Stephen J. Blackband

McKnight Brain Institute, Université de Floride, Gainesville, Floride, États-Unis d'Amérique

Jeremy J. Flint, Kannan Menon et Stephen J. Blackband

Département de génie biomédical, Université de Floride, Gainesville, Floride, États-Unis d'Amérique

Je soutiens Menon

Centre de neurosciences fonctionnellement intégratives, Université d'Aarhus, Aarhus, Danemark

Brian Hansen

Département de radiologie, Université de Floride, Gainesville, Floride, États-Unis d'Amérique

John Forder

National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University, Tallahassee, Floride, États-Unis d'Amérique

Stephen J. Blackband

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JJF, BH et JF ont conçu le prototype d'appareil de microperfusion JJF et BH ont fabriqué le prototype d'appareil de microperfusion JJF a conçu le prototype d'oxygénateur interne JJF et KM ont fabriqué le prototype d'oxygénateur interne JJF et KM ont effectué la collecte des données BH et JJF ont effectué l'analyse des données JJF, BH, JF, KM et SB ont écrit et édité le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Flint, J., Menon, K., Hansen, B. et al. Un système de microperfusion et d'oxygénation interne conçu pour les études de microscopie par résonance magnétique sur des explants de tissus vivants. Sci Rep 5, 18095 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18095

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Reçu : 12 août 2015

Accepté : 06 novembre 2015

Publié: 15 décembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep18095

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